大家看过来---小鼠BM-MSC

yiwuya007

9 R  q- j) X& n$ T- F9 R; W

  q! p1 s' ~; c5 p- [- w+ W5 x! ]分离的小鼠BM-MSC
: A5 D" ^% }$ i6 Q3 O8 J全骨髓法，hyclone的HG-DMEM+10% Hyclone 胎牛血清
! d& I8 Y) p& Q$ q: `传了两次了，但是长得特别慢，一次要10天左右才能传
, r" L7 a) [1 u' C* a照了几张照片，大家看看，有两个问题
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& \8 M( D( [8 I' }, Q' a9 ?7 D1. 为什么细胞分布呈几条平行的直线？（10x那张照片）
/ d  w* o/ @0 Q1 a! N5 ^2 m2 u2. 为什么长得这么慢？培养基和胎牛血清不合适？! o' t/ s7 ~; q9 L# z1 J. @# Q, l
3.为什么有的细胞个体小而且单个分布，有的看似比较大而且长在一起？

wangshan

1.细胞分布呈现平行的直线是特殊现象还是普遍现象？看起来像是特殊区域这样，可能和培养皿有关，比如培养皿有划痕或者生产时coating的不好。2.我曾经分离过BM-MSC，P1代贴壁呈克隆生长时速度较慢，传代后正常速度生长，每三天传代。我使用的是corning LG-DMEM。我遇到的问题是传代到P5左右时细胞生长迟缓，基本不怎么生长。3.看似比较大的生长在一起的是细胞分裂的结果，新分离的BM-MSC贴壁之后是克隆形成阶段。比较小单个分布的细胞如果长不成克隆或慢慢死掉，或状态不好。

yiwuya007

回复 wangshan 的帖子9 A  K- f' b3 i3 D" d

4 N1 u9 u: `* B( m; P( m1. 细胞分布呈线性的问题：我们传了两代，在每个皿中都看到了这种现象
( X8 F. l0 ?( q1 q3 ^2 b2. 我们分离后，传了两次，1：2 和1：1.5传，每次都非常慢4 D$ B1 [; k( ?' z9 b
3.正像你所说的，单个分布的，好像不能形成克隆。是什么原因导致这些单个分布的不形成克隆呢？
4 R5 b' q( s" y4 D2 L8 v! I3 X3 C

gzeb

先提高血清浓度试试，你是刚开始第一次做这类细胞培养吗？以前有没有出现类似情况。还有就是你这培养基多久了？是买500ml现成的还是自己配制的，加点谷氨酰胺试试。

倒腾细胞

您这个图片是处于哪个阶段的细胞？传代？第几天？原代细胞是个什么密度状态？提高浓度的话可以试试15%，1:1传代。培养基里的谷氨酰胺最多保持2周，之后需额外添加。单个细胞确定不是杂质细胞吗？传代前可用PBS冲洗下。MSC生长具有细胞密度依赖性，单个不能克隆可以是因为缺少细胞间的crosstalk吧（菜鸟，不是很懂）。这么规整的平行线条确实蛮像人为造成的，说不定是这个批次的培养瓶的问题。个人愚见，请前辈们多加指点

yiwuya007

回复 倒腾细胞 的帖子) [* U# b* `8 j( j2 s7 W) K

. X2 l0 ^* ]3 ?" A* E1 h9 W6 x4 b刚刚传过两代的细胞，6/16刚刚分离的，原代细胞长了3-4天就长满了，8 c$ g) |, ]3 |9 t5 C7 q1 v" U* a
谷氨酰胺我没有额外加，可能是这个原因？

yiwuya007

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6 w+ z" c6 z0 n. K. X0 `( M* E$ i, H& J, {' p2 {8 k: \& f
也是最近才开始养这个细胞，前面分过一次，老化了。2 i( y* O9 y, ]
前面一次也出现了分布呈线性- G2 r$ ~( ~, e/ c# f
培养基是买的Hyclone的500mL的液体，用之前，上周刚刚加了FBS。
/ a' F' b  `1 C2 ]没有加谷氨酰胺

luyue6453

回复 yiwuya007 的帖子5 [5 U8 ~' U7 Y# @

: H+ V! Z5 u* E  ?成线生长是因为你的底壁被移液管划痕了，细胞有边缘生长趋势，总这样，没关系，一开始长的慢，都要10天左右，等传两代就好了

yiwuya007

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' B$ Z2 H4 I0 C3 T( V* {  x6 C7 d+ L) R; H5 k& N& A$ a
你的意思是长得慢也是正常的？
- S8 J" m7 `2 ?+ g1 C- j, K, F: c7 y$ o0 `" p非常担心老化了，因为第一次分离的细胞就老化了

sysuhoo

基本同意二楼的意见，直线应该是人为造成，这个不需要深究。但楼主的细胞状态确实不好。个人认为有3个因素：1、细胞传代时细胞密度太低了，导致出现了大量的像布一样摊开的细胞形态；2、楼主过于急迫，小鼠的MSCs与其他的MSCs都不一样，具体请参见最新的一篇Cell Stem Cell综述，它有一个静息期；3、血清的浓度偏低，建议20%比较合适，特别是在早期阶段。