大家看过来---小鼠BM-MSC

yiwuya007

1 b, {4 E, E- t

! d% j. }  K7 c# v7 b, Y分离的小鼠BM-MSC
/ Y7 F# A6 H, o0 d, J; g$ L全骨髓法，hyclone的HG-DMEM+10% Hyclone 胎牛血清6 g6 p6 d% e- R. v2 U( ?
传了两次了，但是长得特别慢，一次要10天左右才能传# D  r4 R- _& h# {( \& l
照了几张照片，大家看看，有两个问题/ r9 k4 w6 u/ }% Q' j

  g5 T. e7 D9 q; @1 ]- P1 w1 Z1. 为什么细胞分布呈几条平行的直线？（10x那张照片）/ M; ?6 ?- f) q- C
2. 为什么长得这么慢？培养基和胎牛血清不合适？
# B# ^- t. A. K; E8 E+ Y' c3.为什么有的细胞个体小而且单个分布，有的看似比较大而且长在一起？

wangshan

1.细胞分布呈现平行的直线是特殊现象还是普遍现象？看起来像是特殊区域这样，可能和培养皿有关，比如培养皿有划痕或者生产时coating的不好。2.我曾经分离过BM-MSC，P1代贴壁呈克隆生长时速度较慢，传代后正常速度生长，每三天传代。我使用的是corning LG-DMEM。我遇到的问题是传代到P5左右时细胞生长迟缓，基本不怎么生长。3.看似比较大的生长在一起的是细胞分裂的结果，新分离的BM-MSC贴壁之后是克隆形成阶段。比较小单个分布的细胞如果长不成克隆或慢慢死掉，或状态不好。

yiwuya007

回复 wangshan 的帖子. ^- l1 [$ X* e  t' z& g2 L
3 n6 Z( `8 @/ s1 g. e
1. 细胞分布呈线性的问题：我们传了两代，在每个皿中都看到了这种现象
# z3 }3 t- K2 N! ~$ @6 Y2. 我们分离后，传了两次，1：2 和1：1.5传，每次都非常慢, z- P3 [9 @6 i
3.正像你所说的，单个分布的，好像不能形成克隆。是什么原因导致这些单个分布的不形成克隆呢？
( }+ ?( F; H5 C  k. i) m6 }

gzeb

先提高血清浓度试试，你是刚开始第一次做这类细胞培养吗？以前有没有出现类似情况。还有就是你这培养基多久了？是买500ml现成的还是自己配制的，加点谷氨酰胺试试。

倒腾细胞

您这个图片是处于哪个阶段的细胞？传代？第几天？原代细胞是个什么密度状态？提高浓度的话可以试试15%，1:1传代。培养基里的谷氨酰胺最多保持2周，之后需额外添加。单个细胞确定不是杂质细胞吗？传代前可用PBS冲洗下。MSC生长具有细胞密度依赖性，单个不能克隆可以是因为缺少细胞间的crosstalk吧（菜鸟，不是很懂）。这么规整的平行线条确实蛮像人为造成的，说不定是这个批次的培养瓶的问题。个人愚见，请前辈们多加指点

yiwuya007

回复 倒腾细胞 的帖子4 j- M' I4 v/ g  B8 G9 [
. i& y1 G7 O2 C6 e1 d+ D( N% Q
刚刚传过两代的细胞，6/16刚刚分离的，原代细胞长了3-4天就长满了，
- B3 N7 p1 ?; T2 h/ R4 ~谷氨酰胺我没有额外加，可能是这个原因？

yiwuya007

回复 gzeb 的帖子
$ Y- z; R2 v+ J" i% Z/ H
6 Y; u: [  y* N8 s& q5 v$ n9 `也是最近才开始养这个细胞，前面分过一次，老化了。% x6 u) A' s# d" L
前面一次也出现了分布呈线性7 b9 d: r  U% ~4 f! F
培养基是买的Hyclone的500mL的液体，用之前，上周刚刚加了FBS。: ^3 l  g% A- l: Z  m# u  v* H
没有加谷氨酰胺

luyue6453

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- b; ?3 c$ d+ L; G  H5 S4 }3 x5 l; O& V0 t% A0 G, c! X; t
成线生长是因为你的底壁被移液管划痕了，细胞有边缘生长趋势，总这样，没关系，一开始长的慢，都要10天左右，等传两代就好了

yiwuya007

回复 luyue6453 的帖子& K3 r5 s, T2 v, Q0 g

2 Y3 m) }6 H% N/ z' W你的意思是长得慢也是正常的？. H" @. D( ~7 b- t
非常担心老化了，因为第一次分离的细胞就老化了

sysuhoo

基本同意二楼的意见，直线应该是人为造成，这个不需要深究。但楼主的细胞状态确实不好。个人认为有3个因素：1、细胞传代时细胞密度太低了，导致出现了大量的像布一样摊开的细胞形态；2、楼主过于急迫，小鼠的MSCs与其他的MSCs都不一样，具体请参见最新的一篇Cell Stem Cell综述，它有一个静息期；3、血清的浓度偏低，建议20%比较合适，特别是在早期阶段。