大家看过来---小鼠BM-MSC

yiwuya007

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分离的小鼠BM-MSC
# u  A$ U) Q% A& U1 R1 H1 {( L; X8 g全骨髓法，hyclone的HG-DMEM+10% Hyclone 胎牛血清/ E( \  A) ?7 U$ B2 W" B. c2 q
传了两次了，但是长得特别慢，一次要10天左右才能传
. r: m; F7 b1 {. x8 A照了几张照片，大家看看，有两个问题
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1. 为什么细胞分布呈几条平行的直线？（10x那张照片）
2 x, K9 X( K, Q! p, Q2. 为什么长得这么慢？培养基和胎牛血清不合适？) _# P7 I+ `5 m$ O7 \
3.为什么有的细胞个体小而且单个分布，有的看似比较大而且长在一起？

wangshan

1.细胞分布呈现平行的直线是特殊现象还是普遍现象？看起来像是特殊区域这样，可能和培养皿有关，比如培养皿有划痕或者生产时coating的不好。2.我曾经分离过BM-MSC，P1代贴壁呈克隆生长时速度较慢，传代后正常速度生长，每三天传代。我使用的是corning LG-DMEM。我遇到的问题是传代到P5左右时细胞生长迟缓，基本不怎么生长。3.看似比较大的生长在一起的是细胞分裂的结果，新分离的BM-MSC贴壁之后是克隆形成阶段。比较小单个分布的细胞如果长不成克隆或慢慢死掉，或状态不好。

yiwuya007

回复 wangshan 的帖子9 N: V9 E  y9 I$ i8 }5 L9 v
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1. 细胞分布呈线性的问题：我们传了两代，在每个皿中都看到了这种现象
3 k. v; z- R' h9 m( m2. 我们分离后，传了两次，1：2 和1：1.5传，每次都非常慢4 }8 I1 ?% W- t
3.正像你所说的，单个分布的，好像不能形成克隆。是什么原因导致这些单个分布的不形成克隆呢？
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gzeb

先提高血清浓度试试，你是刚开始第一次做这类细胞培养吗？以前有没有出现类似情况。还有就是你这培养基多久了？是买500ml现成的还是自己配制的，加点谷氨酰胺试试。

倒腾细胞

您这个图片是处于哪个阶段的细胞？传代？第几天？原代细胞是个什么密度状态？提高浓度的话可以试试15%，1:1传代。培养基里的谷氨酰胺最多保持2周，之后需额外添加。单个细胞确定不是杂质细胞吗？传代前可用PBS冲洗下。MSC生长具有细胞密度依赖性，单个不能克隆可以是因为缺少细胞间的crosstalk吧（菜鸟，不是很懂）。这么规整的平行线条确实蛮像人为造成的，说不定是这个批次的培养瓶的问题。个人愚见，请前辈们多加指点

yiwuya007

回复 倒腾细胞 的帖子2 |; O0 A3 Z2 [! ]& k. j9 q
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刚刚传过两代的细胞，6/16刚刚分离的，原代细胞长了3-4天就长满了，
* A$ C+ c: ~/ f6 D谷氨酰胺我没有额外加，可能是这个原因？

yiwuya007

回复 gzeb 的帖子5 m) {$ V, B) g! b6 J! ]

$ g6 D3 O2 J/ _1 D% ?; K也是最近才开始养这个细胞，前面分过一次，老化了。
# w5 z, r' o: W# m7 L前面一次也出现了分布呈线性
3 z' }4 K; F: S) E) J培养基是买的Hyclone的500mL的液体，用之前，上周刚刚加了FBS。
+ d" o! x1 R# r0 w7 Y没有加谷氨酰胺

luyue6453

回复 yiwuya007 的帖子$ O5 o% [# i6 |

2 h9 v/ I, D5 B  i& @) `1 X成线生长是因为你的底壁被移液管划痕了，细胞有边缘生长趋势，总这样，没关系，一开始长的慢，都要10天左右，等传两代就好了

yiwuya007

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7 H' {1 V, @# r/ w
$ t' \8 E$ l5 o1 A你的意思是长得慢也是正常的？
' P5 I  v) ~" c0 z: _5 V非常担心老化了，因为第一次分离的细胞就老化了

sysuhoo

基本同意二楼的意见，直线应该是人为造成，这个不需要深究。但楼主的细胞状态确实不好。个人认为有3个因素：1、细胞传代时细胞密度太低了，导致出现了大量的像布一样摊开的细胞形态；2、楼主过于急迫，小鼠的MSCs与其他的MSCs都不一样，具体请参见最新的一篇Cell Stem Cell综述，它有一个静息期；3、血清的浓度偏低，建议20%比较合适，特别是在早期阶段。