培养脐带干细胞没有成功，恳请各位老师指教，谢谢您！！

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$ _% x2 W) K) U6 u我的操作步骤：
/ p9 a5 C% c+ J8 Y& D5 [/ m( h1.手术室无菌剪取的脐带保存在【4℃含200u/ml青霉素,200ug/ml链霉素的DMEM/F12】中，12h之内带回实验室处理；【以下操作均在冰盒上进行：】4 w8 f. I& g/ b, G8 V
2.超净台内，选取血管内无明显瘀血的脐带小段约2CM长度，剪取后放入【含双抗的PBS溶液中】冲洗4次，将血管内残留血液洗净，直至PBS无明显颜色变化为止；3 k, R; J8 v4 {* V! s
3.小皿内、在DMEM/F12浸泡下对脐带进行分离，待2根动脉分离完毕后，用持针器撕取位于脐带羊膜和静脉之间的胶状组织；
1 s- d, `: M) c1 [6 p% A4.用解剖剪将撕取的条索状组织剪碎，呈小颗粒状，大小约1-2立方毫米；
" B2 W( p. B2 ?8 G3 z5.“NEST”  T25培养瓶用FBS润湿瓶底以后，将小组织块接种到瓶底，约20-25块/瓶；* |; l7 Y; u. L" M; X4 s
6.将接种后培养瓶倒置，放到37℃、5% CO2的培养箱中孵育；& r* d) M  ?+ U. ?8 ]
7.将倒置的培养瓶分为3批，分别在倒置后18h、20h、22h将瓶子进行翻转（此时组织块周围形成一层膜状液体，有轻微流动性），滴加2.5ml培养液【10% FBS、2mM谷氨酰胺、100u/ml青霉素,100ug/ml链霉素、89% DMEM/F12】，正置、培养箱内继续孵育；
1 I; z" Y  v! M4 }* L8.培养瓶翻转后第6天，培养液呈淡黄色，予以半量换液，添加3ml培养液；
# A1 Y/ o3 `0 e9.今天是换液后第4天，（培养后第10天）培养液颜色变化不太明显，呈淡红色，镜下观察无细胞游出，未予换液，打算3天后再行观察换液。* V& O. h! h- f/ D* z

" j* F2 S. [$ ~2 \***另外，我的FBS--- Giboco；DMEM/F12---HyClone；双抗---Sigma； 谷氨酰胺---Amresco;  PBS---Solarbio粉末自己配的。8 q  a) D9 X; d7 a* u
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我的问题：这次培养的组织块，贴壁很牢，第一次换液几乎没有组织块脱落，由于组织块较小，几乎呈单细胞层进行贴壁，镜下观察细胞间融合也还好，，但是感觉细胞代谢很慢，培养液颜色变化很少，还是淡红色，第10天还是没有细胞游出来。感觉好迷茫......是我的培养方法有问题吗？我养这个细胞已经3个多月了，一直没有成功，真的要哭死了，恳请各位老师指导！！谢谢了！！4 `2 R' e# Y7 L& b- e
附图：今天拍的组织块，第一张10倍，第2张15倍
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回复 李敏拉 的帖子/ {' M0 x, S' |/ q
9 M# k/ ]! ~9 d) G) j" t/ w
呵呵。我后来成功了。
. e5 ?& A+ s, @我认为最关键的是，一定要最新鲜的脐带组织。要生下来就立马运输动手实验，越快越好。然后取了华通胶，剪碎，直接放到培养皿上面，超净台里面风机吹2-3分钟，把组织块周围水吹干了，然后立马小心滴加培养液，刚刚保持组织块湿润就OK。
% E  ]. _& ]* {" @过24小时小心滴加培养液，浸没培养液，然后就千万别动它了。
) p* B3 o1 Z$ o隔着培养箱的玻璃门观察，直到培养液颜色变金黄了，可以半量换液。反正前两周，千万别没事去动它，除非要换液。就这样等到它长出来。

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回复 fengtingyong 的帖子: Q) N0 M' l1 I& d
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哈哈，谢谢呀！后面我成功了，发现关键之一是，要让组织块尽早接触培养基。

fengtingyong

操作应该没有多大问题，你在接种时你的组织块应该加少许的培养液润一润组织块之后倒置，隔夜换液，应该会爬出来了，以后看涨势添加培养液。希望你能成功！

李敏拉

培养几天后换液时发现有粘稠液体，换液时把它吸走了，然后换上新鲜的培养液，这样可以吗？那粘稠的液体：好像是组织边缘融化于培养基中，也就不可能会贴壁，
" c$ ]4 V/ T5 b4 m2 K6 S! Q6 Y吸掉可以吗？% c7 T; G, A) Y, l

baby00000003

时间还早，耐心等~

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回复 yinff1988 的帖子
( e0 e: o3 o/ L" j' F9 P# i
* j7 ]" y3 x0 ~$ `  G我还没有成功，你懂的。不过无论是文献还是论坛里的经验，有人用DMEM/LG成功的，应该影响不大。

yinff1988

现在大家都用F12吗？不用DMEM/低糖吗？

lovesxj941

回复 cloud100 的帖子
. N) q5 f9 n& H5 q
; w+ V* g" C. F1 J恩，酶消化法更好，必须的。

cloud100

回复 yongganyixie 的帖子
) p5 R. w6 J( c/ n0 y$ G
: U6 D, K: V* }: L. @嗯， 第一次换液是第6天，后面看培养液变金黄色换，大概4-5天的样子，应该不是粘稠的。比较清亮。