培养脐带干细胞没有成功，恳请各位老师指教，谢谢您！！

cloud100

* \" T& U4 z! |7 b我的操作步骤：9 u3 Z4 I  C/ F( B8 v9 t
1.手术室无菌剪取的脐带保存在【4℃含200u/ml青霉素,200ug/ml链霉素的DMEM/F12】中，12h之内带回实验室处理；【以下操作均在冰盒上进行：】0 a( U3 v8 i1 x) w. _+ e
2.超净台内，选取血管内无明显瘀血的脐带小段约2CM长度，剪取后放入【含双抗的PBS溶液中】冲洗4次，将血管内残留血液洗净，直至PBS无明显颜色变化为止；
) z- s# C4 l* @3.小皿内、在DMEM/F12浸泡下对脐带进行分离，待2根动脉分离完毕后，用持针器撕取位于脐带羊膜和静脉之间的胶状组织；& F% J% N; H. z$ w; |& S: u2 ~
4.用解剖剪将撕取的条索状组织剪碎，呈小颗粒状，大小约1-2立方毫米；  A) ~1 s: P  ~* K2 c5 Y' J9 h0 e
5.“NEST”  T25培养瓶用FBS润湿瓶底以后，将小组织块接种到瓶底，约20-25块/瓶；
, y( ~3 t' r0 w, m9 z  H6.将接种后培养瓶倒置，放到37℃、5% CO2的培养箱中孵育；
5 u4 y, T' y% a9 P# ^7.将倒置的培养瓶分为3批，分别在倒置后18h、20h、22h将瓶子进行翻转（此时组织块周围形成一层膜状液体，有轻微流动性），滴加2.5ml培养液【10% FBS、2mM谷氨酰胺、100u/ml青霉素,100ug/ml链霉素、89% DMEM/F12】，正置、培养箱内继续孵育；
0 m. h* T' l/ [+ \7 N2 G8.培养瓶翻转后第6天，培养液呈淡黄色，予以半量换液，添加3ml培养液；
8 b" j5 v/ X0 L7 v0 u' V2 x5 p9 \9.今天是换液后第4天，（培养后第10天）培养液颜色变化不太明显，呈淡红色，镜下观察无细胞游出，未予换液，打算3天后再行观察换液。8 h! }6 c8 B8 E$ u4 A' z) K
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***另外，我的FBS--- Giboco；DMEM/F12---HyClone；双抗---Sigma； 谷氨酰胺---Amresco;  PBS---Solarbio粉末自己配的。* s- Z( i% P, c& h
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我的问题：这次培养的组织块，贴壁很牢，第一次换液几乎没有组织块脱落，由于组织块较小，几乎呈单细胞层进行贴壁，镜下观察细胞间融合也还好，，但是感觉细胞代谢很慢，培养液颜色变化很少，还是淡红色，第10天还是没有细胞游出来。感觉好迷茫......是我的培养方法有问题吗？我养这个细胞已经3个多月了，一直没有成功，真的要哭死了，恳请各位老师指导！！谢谢了！！
3 k" W6 ~$ _) p/ \3 G附图：今天拍的组织块，第一张10倍，第2张15倍
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jianglei_sd

直接将剪碎的组织块转移到T25瓶子，不用FBS润湿。" H4 o; @4 ^: O

7 f+ n3 d3 o3 h* G另外2,3,4步操作要快，不用剪的太碎，不要在冰上太长时间。

单个核细胞

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请参照这篇文章的方法试一下：
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另，推荐阅读：3 I6 n2 n  \, [* T0 _5 o8 j6 n3 Y
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• 脐带间充质干细胞的贴壁分离方法：
  # o6 [9 v- c+ |$ Q4 @http://www.stemcell8.cn/forum-vi ... rby%3Ddateline.html
• 请教华通氏胶的剥离：
  ! z: R3 A- ?9 Z* R4 M7 ^+ E. \http://www.stemcell8.cn/forum-vi ... rby%3Ddateline.html
• 应用怎么样的培养技巧可以获得更完美脐带间充质干细胞：+ e8 N! H6 q) O$ j+ y1 M
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• 脐带间充质胶质的备置：
  7 y  Z: S) ]7 A1 D1 O' ?http://www.stemcell8.cn/forum-vi ... rby%3Ddateline.html
• 脐带间充质细胞贴壁法出芽率怎么这么低：
  ( W: G) D+ \5 [3 u! O+ Ehttp://www.stemcell8.cn/forum-vi ... rby%3Ddateline.html
• 脐带间充质贴壁法到底几天换液：
    ]* u- A& y6 c$ v& i& P1 v( f5 Bhttp://www.stemcell8.cn/forum-vi ... rby%3Ddateline.html
• 各位大虾能把自己养的脐带间充质细胞出来晒晒吗?7 s/ v( b7 H3 r/ [
  http://www.stemcell8.cn/forum-re ... 79-pid-644496.htmll

月_幻影

我与LZ的培养情况有点相似，都是换液的时候很少有组织块掉下来，不过建议LZ再等等，一般我做原代怎么也得两周（14、5天）后才有成片的细胞爬出，还有个人感觉铺瓶的时候不用PBS湿润，直接铺瓶倒置培养4H或过夜后加培养液正置培养即可……祝LZ成功~

月_幻影

我与LZ的培养情况有点相似，都是换液的时候很少有组织块掉下来，不过建议LZ再等等，一般我做原代怎么也得两周（14、5天）后才有成片的细胞爬出，还有个人感觉铺瓶的时候不用PBS湿润，直接铺瓶倒置培养4H或过夜后加培养液正置培养即可……祝LZ成功~

frankhu

看了楼主的实验过程，觉得太过于复杂了，脐带间充质贴壁培养相对来说比较简单，取回的拨完脐带，剪成米粒大小，然后均匀平铺在瓶底，加的培养基要浸润组织但不浮起来为准，培养4小时后补加培养基完全浸没组织，继续培养，然后观察到细胞游离出来，培养基颜色变黄后首次换液。接下来就是隔天换液，待瓶子长满后传代。

cloud100

回复 jianglei_sd 的帖子: d( [2 B! k- A1 v

$ L$ `8 u  v6 t9 n* r8 F- u啊，我之前剪得组织块比较大，可能有个3-4mm长吧，后面全部浮起来了。这次我剪得很碎小，只有1-2mm大小。

cloud100

回复 单个核细胞 的帖子! B, y9 F) s2 Q) U

" W5 T0 u+ z) J- i# M好的，谢谢您的指点。。。

cloud100

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好的，谢谢您！！我再等等。

cloud100

回复 frankhu 的帖子8 R0 g4 C& x: P' S& S, s/ h
! Q- i" E8 }, e+ N, V
我之前没有倒置培养，组织块也比这次要大一些，厚一些，但组织块贴壁很松，换液时全掉了，，然后，还想请问您，隔天换液时必须的吗？培养基颜色没有明显变化也要隔天换液吗？