培养脐带干细胞没有成功，恳请各位老师指教，谢谢您！！

cloud100

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我的操作步骤：7 C1 T+ o. M  e& y
1.手术室无菌剪取的脐带保存在【4℃含200u/ml青霉素,200ug/ml链霉素的DMEM/F12】中，12h之内带回实验室处理；【以下操作均在冰盒上进行：】. `1 Q* U, _$ ~* L# e+ k% n
2.超净台内，选取血管内无明显瘀血的脐带小段约2CM长度，剪取后放入【含双抗的PBS溶液中】冲洗4次，将血管内残留血液洗净，直至PBS无明显颜色变化为止；+ U' |$ w" r7 H& o' }& l: v
3.小皿内、在DMEM/F12浸泡下对脐带进行分离，待2根动脉分离完毕后，用持针器撕取位于脐带羊膜和静脉之间的胶状组织；
3 E1 F. [1 y1 {+ b8 N4.用解剖剪将撕取的条索状组织剪碎，呈小颗粒状，大小约1-2立方毫米；
8 C% O; O9 h' u; z- s( E5.“NEST”  T25培养瓶用FBS润湿瓶底以后，将小组织块接种到瓶底，约20-25块/瓶；
# w( G$ ?3 x! N7 w% s6 A) f& {; _6.将接种后培养瓶倒置，放到37℃、5% CO2的培养箱中孵育；
9 V! E1 {+ _. l: w8 m2 f7.将倒置的培养瓶分为3批，分别在倒置后18h、20h、22h将瓶子进行翻转（此时组织块周围形成一层膜状液体，有轻微流动性），滴加2.5ml培养液【10% FBS、2mM谷氨酰胺、100u/ml青霉素,100ug/ml链霉素、89% DMEM/F12】，正置、培养箱内继续孵育；) }6 U0 R/ |) ~7 K2 g
8.培养瓶翻转后第6天，培养液呈淡黄色，予以半量换液，添加3ml培养液；
  u- w: r; e# ?) X+ ?8 v9.今天是换液后第4天，（培养后第10天）培养液颜色变化不太明显，呈淡红色，镜下观察无细胞游出，未予换液，打算3天后再行观察换液。: u' ?# k( V0 p  D& P3 z
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***另外，我的FBS--- Giboco；DMEM/F12---HyClone；双抗---Sigma； 谷氨酰胺---Amresco;  PBS---Solarbio粉末自己配的。
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) Z+ c  F: ^& F$ M$ f我的问题：这次培养的组织块，贴壁很牢，第一次换液几乎没有组织块脱落，由于组织块较小，几乎呈单细胞层进行贴壁，镜下观察细胞间融合也还好，，但是感觉细胞代谢很慢，培养液颜色变化很少，还是淡红色，第10天还是没有细胞游出来。感觉好迷茫......是我的培养方法有问题吗？我养这个细胞已经3个多月了，一直没有成功，真的要哭死了，恳请各位老师指导！！谢谢了！！0 W) y! R8 }7 }) C! b
附图：今天拍的组织块，第一张10倍，第2张15倍
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jianglei_sd

直接将剪碎的组织块转移到T25瓶子，不用FBS润湿。
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  }6 j/ @! W& c  D8 \% j另外2,3,4步操作要快，不用剪的太碎，不要在冰上太长时间。

单个核细胞

) `: O; L& @% t2 i. r5 f
" a( K0 T  w2 O- V$ M" W" s7 S5 |回复 cloud100 的帖子
9 v) u! a' g; t: u  v' h; H7 }+ k3 L: n
请参照这篇文章的方法试一下：" y4 R# x  v6 o( o4 e; j- ]: q

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9 `# v8 B$ S( E; Z0 i另，推荐阅读：. y. W* s" {; R9 l& Z4 n0 m
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• 脐带间充质干细胞的贴壁分离方法：
    Q: J- |) s, T& f7 H3 e6 [http://www.stemcell8.cn/forum-vi ... rby%3Ddateline.html
• 请教华通氏胶的剥离：
  $ g% i* Q9 d2 X" Z0 T- thttp://www.stemcell8.cn/forum-vi ... rby%3Ddateline.html
• 应用怎么样的培养技巧可以获得更完美脐带间充质干细胞：' w: d0 B8 A" |3 R0 c4 y0 E
  http://www.stemcell8.cn/forum-vi ... rby%3Ddateline.html
• 脐带间充质胶质的备置：+ w! B2 s" y/ p# K: k2 ~
  http://www.stemcell8.cn/forum-vi ... rby%3Ddateline.html
• 脐带间充质细胞贴壁法出芽率怎么这么低：* p8 a. j- {2 o% L7 G) j
  http://www.stemcell8.cn/forum-vi ... rby%3Ddateline.html
• 脐带间充质贴壁法到底几天换液：
  2 N; [6 U: ~* R3 ?: |& {http://www.stemcell8.cn/forum-vi ... rby%3Ddateline.html
• 各位大虾能把自己养的脐带间充质细胞出来晒晒吗?8 A7 R  u$ ], [9 [
  http://www.stemcell8.cn/forum-re ... 79-pid-644496.htmll

月_幻影

我与LZ的培养情况有点相似，都是换液的时候很少有组织块掉下来，不过建议LZ再等等，一般我做原代怎么也得两周（14、5天）后才有成片的细胞爬出，还有个人感觉铺瓶的时候不用PBS湿润，直接铺瓶倒置培养4H或过夜后加培养液正置培养即可……祝LZ成功~

月_幻影

我与LZ的培养情况有点相似，都是换液的时候很少有组织块掉下来，不过建议LZ再等等，一般我做原代怎么也得两周（14、5天）后才有成片的细胞爬出，还有个人感觉铺瓶的时候不用PBS湿润，直接铺瓶倒置培养4H或过夜后加培养液正置培养即可……祝LZ成功~

frankhu

看了楼主的实验过程，觉得太过于复杂了，脐带间充质贴壁培养相对来说比较简单，取回的拨完脐带，剪成米粒大小，然后均匀平铺在瓶底，加的培养基要浸润组织但不浮起来为准，培养4小时后补加培养基完全浸没组织，继续培养，然后观察到细胞游离出来，培养基颜色变黄后首次换液。接下来就是隔天换液，待瓶子长满后传代。

cloud100

回复 jianglei_sd 的帖子
8 S: K+ R8 e1 X5 E4 P, `4 t7 x; B: T; c% Y
/ L/ p" Z( s: E; I/ y; `4 |/ {% l啊，我之前剪得组织块比较大，可能有个3-4mm长吧，后面全部浮起来了。这次我剪得很碎小，只有1-2mm大小。

cloud100

回复 单个核细胞 的帖子5 r: d+ s1 e6 r$ U7 V
8 N" n4 m, D! L8 H
好的，谢谢您的指点。。。

cloud100

回复 月_幻影 的帖子* v( [- L1 u* c

) C5 Z1 i8 x9 |好的，谢谢您！！我再等等。

cloud100

回复 frankhu 的帖子' Q5 Q* _% }7 K- U! k& {0 I* {: X* j

+ }" g( k8 B5 @+ _0 X1 b, ]我之前没有倒置培养，组织块也比这次要大一些，厚一些，但组织块贴壁很松，换液时全掉了，，然后，还想请问您，隔天换液时必须的吗？培养基颜色没有明显变化也要隔天换液吗？