求指导NK细胞培养

yangpan521

哪位大神帮我看看这NK培养流程有没有不妥的地方，细胞数量上不去，着急啊4 |. q% L, M5 z6 X0 S8 P! {
培养材料：
8 K" R- G' O# m+ V0 t* s: e无血清培养基GT -T551、生理盐水、淋巴细胞分离液Ficoll、人血白蛋白、自体血浆  z5 O* q5 q! P. J5 m
细胞因子：IL-2（1000IU/ml）、Anti-Human CD3（5ug/ml）、IL-12(500IU/ml）、IL-15(500IU/ml）0 B& Z) P/ J. M. k, w  u# z
操作步骤：
1 x7 R( {' T) q1、采血机采集外周成分血50ml ，用生理盐水1:1进行稀释，& [" u9 K4 D1 N. X) ?0 ?
2、由Ficoll液分离，去红细胞，收集初步纯化的单个核细胞：经Ficoll液梯度离心分离单个核细胞，Ficoll液与待分离的单个核细胞悬液比例为3:5分离方法: 取新的50ml离心管，没管加入15mlFicoll分离液，将25ml单核细胞悬液，贴壁轻轻加入管中Ficoll液液面上，注意单个核细胞悬液的加入不能打破离心管中Ficoll液的液面，离心2000rpm/min，20min，升速1，降速0，离心后，液面分为四层，小心吸取第二层的单核细胞层，用无血清GT-T551洗涤2次，离心1800rpm/min，5min，20℃，弃去上清，再用5ml无血清培养液混悬。
* H" m3 o7 H7 Q3、细胞计数：吸取约200ul的细胞悬液与1.5mlEP管内，另取一个新的EP管加入90ul台盼蓝和10ul细胞悬液，用血球计数板进计数。
  J1 }4 F$ {/ r, |3 W4、将PBMC密度调整为2X106/ml，转入T75瓶中，培养基加入CD3McAb、IL-2、IL-12、IL-15，并置于培养箱中培养。每隔3d半量换液，并补充相应的细胞因子和自体血浆。
; y+ n$ `9 |' {$ ?0 ~2 {5、收集悬浮细胞：培养第10d观察NK细胞并收获NK：将培养瓶内细胞悬液转移至50ml的离心管中，1800rpm,离心5min。去上清，用生理盐水再洗细胞2遍，最后将细胞组分混悬在100ml含1%人血清白蛋白注射用生理盐水中，转入细胞回输袋内，制成NK回输液。
% K) P# B  h2 @& q! c* i1 `

pppjjj

大约能扩增多少倍啊？

yangpan521

回复 pppjjj 的帖子
- n* t& V! j# n$ m! }5 i: G. {
  o* d1 [' _, g7 e! W7 P$ m90倍，有的低，都说可以扩大120倍，也不知哪出问题了

wind789

我看文献上类似方法有滋养细胞共育的。另外楼主你10天时,CD3-CD56+细胞的比例大概是多少呢？双阳的细胞大概是多少呢？

gondobar

楼主如果在成本允许的情况下，可以换更高级的培养基，90倍完全可以达到回输要求……

yangpan521

回复 wind789 的帖子2 _* o7 r6 n. P) l- t8 Z# N' o: r# W
! w; G' i- G7 ~  e9 F. B
20%左右

yangpan521

回复 gondobar 的帖子: e/ `- [' }$ @, x& G" w  c
/ s& o0 h( g( n* V7 E9 q
请问我上面的培养不骤没什么问题吧

gondobar

回复 yangpan521 的帖子
% ~( }) D% Z' J7 Z) P  H$ ~% [& c) V$ n6 p, T7 b1 X6 k) a6 O
细胞分离过程和我们不一样，不知道你的方法能得到多少种子细胞。我们大约在5左右（七次方），如果你的方法更多，倒是可以学习一下。

wind789

yangpan521 发表于 2014-8-5 13:24
! B+ t; b  U' Y! q* P" p5 g, i回复 wind789 的帖子9 \# z0 C3 R4 e0 P+ ]: [
4 d% t; ^) t8 P1 D/ @
20%左右

/ b7 _& T; g2 B1 L6 X- }% J; @
这种比例还算是NK吗？

单个核细胞

! }( t* {4 i$ E
* E2 q! T; {. |/ b回复 yangpan521 的帖子
9 P! a) K: z$ B2 A3 \1 V1 [
: M' ~" q; r3 u# S: _. d/ w+ `, x推荐阅读：
$ {) n3 G! i/ X  t' B) U/ d
- ?) g$ b. I+ R! f2 p8 B! AExpansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells
7 [0 {! c2 T4 a/ k0 I$ ^5 v- k% jhttp://www.jove.com/video/2540/e ... an-peripheral-blood" m- s- G! ^) f9 c
8 x0 G$ L& l/ i4 F4 u% Y
方案：+ R0 [5 Y6 \1 x8 r& F6 K

0 F  ^1 E1 B* n8 j% Q7 |" N5 x8 j物料：