求指导NK细胞培养

yangpan521

哪位大神帮我看看这NK培养流程有没有不妥的地方，细胞数量上不去，着急啊4 V. Z1 j- H0 C7 z* N
培养材料：* q/ s  N3 D$ l2 T6 {
无血清培养基GT -T551、生理盐水、淋巴细胞分离液Ficoll、人血白蛋白、自体血浆
0 r( G7 [4 b0 m' r0 Z2 `细胞因子：IL-2（1000IU/ml）、Anti-Human CD3（5ug/ml）、IL-12(500IU/ml）、IL-15(500IU/ml）1 z: I% Y( T0 }' L
操作步骤：) \8 d+ ?3 A( E" k1 I+ A4 u
1、采血机采集外周成分血50ml ，用生理盐水1:1进行稀释，) n; W1 _1 D: w  ]
2、由Ficoll液分离，去红细胞，收集初步纯化的单个核细胞：经Ficoll液梯度离心分离单个核细胞，Ficoll液与待分离的单个核细胞悬液比例为3:5分离方法: 取新的50ml离心管，没管加入15mlFicoll分离液，将25ml单核细胞悬液，贴壁轻轻加入管中Ficoll液液面上，注意单个核细胞悬液的加入不能打破离心管中Ficoll液的液面，离心2000rpm/min，20min，升速1，降速0，离心后，液面分为四层，小心吸取第二层的单核细胞层，用无血清GT-T551洗涤2次，离心1800rpm/min，5min，20℃，弃去上清，再用5ml无血清培养液混悬。
" q$ l2 c  |/ R6 o6 c# a3、细胞计数：吸取约200ul的细胞悬液与1.5mlEP管内，另取一个新的EP管加入90ul台盼蓝和10ul细胞悬液，用血球计数板进计数。
7 k; C, A( @, f$ j( s+ H4、将PBMC密度调整为2X106/ml，转入T75瓶中，培养基加入CD3McAb、IL-2、IL-12、IL-15，并置于培养箱中培养。每隔3d半量换液，并补充相应的细胞因子和自体血浆。
/ b5 x" S- {6 M5、收集悬浮细胞：培养第10d观察NK细胞并收获NK：将培养瓶内细胞悬液转移至50ml的离心管中，1800rpm,离心5min。去上清，用生理盐水再洗细胞2遍，最后将细胞组分混悬在100ml含1%人血清白蛋白注射用生理盐水中，转入细胞回输袋内，制成NK回输液。1 o3 u0 ^6 e6 j1 _

pppjjj

大约能扩增多少倍啊？

yangpan521

回复 pppjjj 的帖子
% q$ m' b+ R9 G3 o) T9 r  |
3 l: {7 X) h; E90倍，有的低，都说可以扩大120倍，也不知哪出问题了

wind789

我看文献上类似方法有滋养细胞共育的。另外楼主你10天时,CD3-CD56+细胞的比例大概是多少呢？双阳的细胞大概是多少呢？

gondobar

楼主如果在成本允许的情况下，可以换更高级的培养基，90倍完全可以达到回输要求……

yangpan521

回复 wind789 的帖子" @9 l* J: a, p6 Y* Y

1 `  Y7 g% i. Z/ b6 o( q20%左右

yangpan521

回复 gondobar 的帖子
7 \2 j( x/ j. K2 j! o; O
/ k8 Z: Z; I" j8 s8 B, F请问我上面的培养不骤没什么问题吧

gondobar

回复 yangpan521 的帖子; z, M3 p* j! A. q8 ~
* K/ v/ U7 l5 g! a
细胞分离过程和我们不一样，不知道你的方法能得到多少种子细胞。我们大约在5左右（七次方），如果你的方法更多，倒是可以学习一下。

wind789

yangpan521 发表于 2014-8-5 13:24
/ f7 e' L- v3 ~1 Y- A( @, c回复 wind789 的帖子( b4 h4 p4 Q. ~3 W! z, E1 H. |$ w8 P& K

; |' T6 _. h( h5 l' N5 V+ j5 |20%左右

3 |* r' p: n) w. O& O
这种比例还算是NK吗？

单个核细胞

5 y/ [: f1 f/ I6 |# V1 K
9 F; Q' ]( L; r5 m& u: k2 R
回复 yangpan521 的帖子- b* g9 o) X9 a
; Y% n* ?% V" f4 B( \9 o# [) N
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Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells; _9 Y7 ]' S- y
http://www.jove.com/video/2540/e ... an-peripheral-blood6 D- |1 p/ f3 K! w8 ^
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方案：. X; h6 k* B; ~- I8 q+ z

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