求指导NK细胞培养

yangpan521

哪位大神帮我看看这NK培养流程有没有不妥的地方，细胞数量上不去，着急啊  Y' w0 v9 P* Z0 @7 H  {: d
培养材料：5 @8 V6 P, d! G' ~, \1 d
无血清培养基GT -T551、生理盐水、淋巴细胞分离液Ficoll、人血白蛋白、自体血浆
8 X  o9 h# y3 P6 p& S1 k6 J细胞因子：IL-2（1000IU/ml）、Anti-Human CD3（5ug/ml）、IL-12(500IU/ml）、IL-15(500IU/ml）
6 v  s, v1 {( C9 a' d8 Y  F操作步骤：# ^, x/ J  l5 ~8 {3 N! [
1、采血机采集外周成分血50ml ，用生理盐水1:1进行稀释，
/ |- n) r7 y" b# ^5 @* N3 k2、由Ficoll液分离，去红细胞，收集初步纯化的单个核细胞：经Ficoll液梯度离心分离单个核细胞，Ficoll液与待分离的单个核细胞悬液比例为3:5分离方法: 取新的50ml离心管，没管加入15mlFicoll分离液，将25ml单核细胞悬液，贴壁轻轻加入管中Ficoll液液面上，注意单个核细胞悬液的加入不能打破离心管中Ficoll液的液面，离心2000rpm/min，20min，升速1，降速0，离心后，液面分为四层，小心吸取第二层的单核细胞层，用无血清GT-T551洗涤2次，离心1800rpm/min，5min，20℃，弃去上清，再用5ml无血清培养液混悬。
. d3 z( [  X4 x5 r9 H3 A3、细胞计数：吸取约200ul的细胞悬液与1.5mlEP管内，另取一个新的EP管加入90ul台盼蓝和10ul细胞悬液，用血球计数板进计数。
4 l3 K# \$ Z6 v0 e+ H/ o7 e- ]/ w4、将PBMC密度调整为2X106/ml，转入T75瓶中，培养基加入CD3McAb、IL-2、IL-12、IL-15，并置于培养箱中培养。每隔3d半量换液，并补充相应的细胞因子和自体血浆。! v4 U- }+ v" X* |) D* q  c4 x
5、收集悬浮细胞：培养第10d观察NK细胞并收获NK：将培养瓶内细胞悬液转移至50ml的离心管中，1800rpm,离心5min。去上清，用生理盐水再洗细胞2遍，最后将细胞组分混悬在100ml含1%人血清白蛋白注射用生理盐水中，转入细胞回输袋内，制成NK回输液。) S& H' I8 i, l% U" O) b) ^

pppjjj

大约能扩增多少倍啊？

yangpan521

回复 pppjjj 的帖子" l5 ~5 K) y2 B, S0 `
" R; N8 v: j: b3 `% l- }) ]
90倍，有的低，都说可以扩大120倍，也不知哪出问题了

wind789

我看文献上类似方法有滋养细胞共育的。另外楼主你10天时,CD3-CD56+细胞的比例大概是多少呢？双阳的细胞大概是多少呢？

gondobar

楼主如果在成本允许的情况下，可以换更高级的培养基，90倍完全可以达到回输要求……

yangpan521

回复 wind789 的帖子  g. k* Y' T2 O) R
( h: j4 k" C7 R8 I- _5 N! ~
20%左右

yangpan521

回复 gondobar 的帖子1 |, I& l, i2 b
' B& B( m& [0 @, P& r- [
请问我上面的培养不骤没什么问题吧

gondobar

回复 yangpan521 的帖子3 E; j. F/ \) q

: h0 [: E5 P# T0 e8 a6 ~细胞分离过程和我们不一样，不知道你的方法能得到多少种子细胞。我们大约在5左右（七次方），如果你的方法更多，倒是可以学习一下。

wind789

yangpan521 发表于 2014-8-5 13:24 . m8 P, Z5 V) I' D
回复 wind789 的帖子
1 s5 S& A* [( |1 b. @7 g8 |% K
% ~3 s2 a" |* x3 @$ M/ F20%左右

& O+ H9 Y# |  X+ A5 A$ b6 w这种比例还算是NK吗？

单个核细胞

; ~6 ?2 F2 Z& F- G
8 _7 Z! u( t5 v. T4 o) R, }
回复 yangpan521 的帖子
9 ?9 x! s8 A+ I: W- k$ N2 ~9 T5 v" E" I! k$ C/ L
推荐阅读：
' v& k- I  |9 I; t: H
3 K* k* a2 V0 a! H5 `Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells
" m3 ?9 c2 p& X# T0 _1 Qhttp://www.jove.com/video/2540/e ... an-peripheral-blood
1 l5 j2 b! O- j" [: Z* F) t. i5 l+ ?$ f. ?
方案：# Z/ S9 g% p% R% F
- J5 ^+ Q4 i! ]2 ~
物料：