求指导NK细胞培养

yangpan521

哪位大神帮我看看这NK培养流程有没有不妥的地方，细胞数量上不去，着急啊
3 [) r. T- k* s9 U0 d培养材料：
. B& F7 d$ k% ~无血清培养基GT -T551、生理盐水、淋巴细胞分离液Ficoll、人血白蛋白、自体血浆! Z$ ^! [& T& o
细胞因子：IL-2（1000IU/ml）、Anti-Human CD3（5ug/ml）、IL-12(500IU/ml）、IL-15(500IU/ml）
/ D7 I8 U' U( t+ ~2 {. f. Q! H( E# N操作步骤：
( h- _' t6 r5 ]: m7 q% N9 y# b1、采血机采集外周成分血50ml ，用生理盐水1:1进行稀释，. v8 i3 ^8 ~5 y" F; R
2、由Ficoll液分离，去红细胞，收集初步纯化的单个核细胞：经Ficoll液梯度离心分离单个核细胞，Ficoll液与待分离的单个核细胞悬液比例为3:5分离方法: 取新的50ml离心管，没管加入15mlFicoll分离液，将25ml单核细胞悬液，贴壁轻轻加入管中Ficoll液液面上，注意单个核细胞悬液的加入不能打破离心管中Ficoll液的液面，离心2000rpm/min，20min，升速1，降速0，离心后，液面分为四层，小心吸取第二层的单核细胞层，用无血清GT-T551洗涤2次，离心1800rpm/min，5min，20℃，弃去上清，再用5ml无血清培养液混悬。
: F' z: D! T& q% g6 Q) a3、细胞计数：吸取约200ul的细胞悬液与1.5mlEP管内，另取一个新的EP管加入90ul台盼蓝和10ul细胞悬液，用血球计数板进计数。$ p  l( z5 g4 D$ F% v* D
4、将PBMC密度调整为2X106/ml，转入T75瓶中，培养基加入CD3McAb、IL-2、IL-12、IL-15，并置于培养箱中培养。每隔3d半量换液，并补充相应的细胞因子和自体血浆。
/ z8 R4 x' e8 A( p, B* }+ Q5、收集悬浮细胞：培养第10d观察NK细胞并收获NK：将培养瓶内细胞悬液转移至50ml的离心管中，1800rpm,离心5min。去上清，用生理盐水再洗细胞2遍，最后将细胞组分混悬在100ml含1%人血清白蛋白注射用生理盐水中，转入细胞回输袋内，制成NK回输液。- P6 v+ o3 I& S0 I

yangpan521

回复 pppjjj 的帖子. A! p. R2 h7 Y; r

9 ?6 o% {9 V/ x' Y- z9 a( I6 l. k90倍，有的低，都说可以扩大120倍，也不知哪出问题了

yangpan521

回复 wind789 的帖子5 H$ v9 v- g2 x7 u3 g
/ Y8 h( S% r$ a% t$ @2 W* q6 Z
20%左右

yangpan521

回复 gondobar 的帖子
+ w! V+ T5 |) t' L3 o* o% H4 S7 l. |, a
请问我上面的培养不骤没什么问题吧

yangpan521

回复 jianglei_sd 的帖子& a8 e3 z' }7 Z" u5 X' P
! A1 c, k% v' t" t6 m6 k* ~5 M- K
还在摸索阶段，请指导

yangpan521

回复 gondobar 的帖子
2 G  _6 ?+ p# I4 i# \
9 |9 O, k. s3 r5 g) f3 v; |请问你是怎么分离的，我还在摸索阶段 ，有很多问题，请指导，谢谢

yangpan521

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3 f5 l/ ]( J# A: Y不是，还要转袋培养