各位老师，求人脐带间充质干细胞

yinff1988

    小女子取人脐带间充质干细胞原代已经有两个月了，取了多次，只有第一次从组织块里爬出细胞，但是细胞状态不好，经过两次传代，细胞就不贴壁了。在剩下的时间里，不管怎样，没有一块组织块有细胞爬出（这让我非常奇怪）。我将取来的脐带放在50ml离心管内，里面盛35mlDMEM/LG,放到碎冰中，拿回实验室（实验室里医院只有50米）。实验中用含有1%双抗的PBS冲洗脐带中的淤血，剖除脐带中的三条血管，然后皿中加入约1.5ml培养液（DMEM/LG+10%FBS+1%双抗）将脐带剪碎，铺皿。第二天再向皿中各加入3-4ml培养液。实验全程都在冰袋上进行，时间约为1.5小时。我就是不明白为什么就是没有细胞，哪怕有一块组织块有细胞爬出。
1 h5 D1 s, [; F$ p1 G    时间紧迫，细胞还是没有眉目，实验无法进行，再此有哪位大神有多余细胞能借我或与我交换，让我的实验能初步进行，顺利毕业！当然，帮指出我的错误之处，同样不胜感激！先谢谢各位啦~

weijunning

回复 倒腾细胞 的帖子
: G) E$ R3 U8 T( J' N3 b( v, @5 t) a- g( e9 ]/ s" M
很好养的啊 我们就是将三根血管剔除后，将剩下组织一起剪碎 ，贴壁牢固后，加培养基，以刚没过组织块为宜，放培养箱培养5天左右，拿出镜下观察就要细胞爬出的。培养基中加入了SCF /bFGF/IL-3/EGF-β。

月_幻影

楼主没有取华通式胶部位而是直接剖出血管后就剪碎了吗，这样的话杂细胞会比较多的，另外在剪碎组织的时候建议用加入培养液的，直接剪碎剖出的华通式胶铺瓶就行，楼主剪碎时加入培养液会让组织块表面湿润而且很滑不易于组织块贴瓶的，不贴瓶如何爬出细胞？$ p( u6 s( z: ]9 d) C
还有整个操作过程也不用在冰上进行的，正常的实验室环境即可、- X" o* q! [" T3 q
一般间充质的原代怎么也得7~14天爬出细胞，楼主要多等两天、、

pcljsw2008

我有多余的细胞，就是怕路远哦

yaoting111

多大的瓶子，加4ml培养液，另外别放碎冰里

yongganyixie

我们一般脐带洗净后，沿静脉管剪开，再取出静脉外膜，然后剔除两条动脉血管，再一点点拔胶，然后减碎，然后用适当培养液铺到瓶里，第二天适量补液，然后再根据细胞变形情况以及培养液颜色变化再适当全量或者半量换液，慢慢细胞就会爬出来了

yinff1988

回复 ytumuyangren 的帖子  V; _/ b. C9 n% A- D

* z3 ^6 `! w$ t, ^5 ?十分感谢！

ytumuyangren

要保证分离得到的脐带间充质干细胞的纯度，无论是组织块法还是酶消化法均需剔除脐带外膜以及动静脉。将分离得到的华通式胶尽可能的剪碎一些，组织贴壁法：将剪成1-2mm3大小的组织块贴于培养皿中（我们经常采用培养皿进行贴壁培养，有的实验室采用培养瓶），组织块间距不可太近，避免爬出的细胞之间产生接触抑制（影响细胞的状态），将培养皿倒置于培养箱中，4h之后添加培养液，三天之后观察是否有细胞爬出，这种方法一般情况下（脐带是否新鲜影响细胞的爬出）5-6d都会有细胞从组织块中爬出，这种方法分离培养细胞所需时间较长；酶消化法分离培养脐带间充质干细胞相比较组织贴壁法较快，采用胶原酶结合胰酶的方法，不过成本较高。楼主可以采用酶消化法尝试一下。祝实验顺利！

baby00000003

羊膜也要剥掉
3 a1 F# v$ ]4 o; h7 H, f淤血要清洗干净，分离后的沃顿胶必须冲洗到白色，贴块儿以后镜下看不到红细胞最好7 }5 N9 u. h3 R( Z
被溶血浸泡太久的样本就不要使用了' @% K) D# l( c# ?
细胞爬出快的要7天左右，慢的可能20多天，不可以着急哈6 ]) R8 h9 ^. M( R% R
操作不用低温，室温的超净台就可以了
2 B: S! C& K- L* U9 T. H( E别的嘛......换换你的一次性耗材品牌、看看是不是培养箱需要重新校准==

weijunning

回复 倒腾细胞 的帖子( B* C5 e/ G. x, A& a8 n; D
1 y. G2 v: W/ v- g7 O7 z
脐带很要养的   别轻易放弃