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胚胎干细胞培养标准化操作规程(SOP)
) `8 C3 M7 z' b) M/ R% G8 L9 B; N. q8 g# S; A! a& {6 i$ W E
目录
* ?+ g8 e, I; y& S0 A8 k一、细胞2 r8 t V# ^! f0 e/ |
二、一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化状态( ?, W! Q4 ?8 W$ |! a1 F/ i
培养基
|- t3 [- j$ k+ g细胞复苏
# v2 O* H& |7 o! |8 V冻存细胞
/ {* b+ q; y4 H5 Y* U2 H明胶包被. W; u5 j7 B% [) N+ T3 A
细胞传代
3 l' t6 z3 }, M. ^& X5 x8 a$ ]8 `三、体外分化
1 ~" ^4 d. o, g培养基
/ u9 ?! S7 g+ {/ I% {包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片） S7 }* U1 i/ N* N5 J) p
体外分化方法9 ]4 A& ]# A8 m; U
四、移植细胞的准备
5 u, ^' `4 u* D0 v: F; {9 e$ v* n1 m( R. d0 h9 {
细胞, l; w: L! }9 L1 p
多能性胚胎干细胞产生于小鼠胚泡4 g) T _* E6 r, f( H, |: n
1．表达绿色荧光蛋白（EGFP）的B5-ES细胞。由Dr. Nagy的实验室制备。
2 ^) w E; p9 L Z5 V: F& U4 a9 ]( q2．D3-ATCC; CRL-1934. 我们得到时大约传了17代。
. x0 p0 g2 O5 Z+ D/ H; E3．J1-由Dr. Jaenish的实验室友情提供。我们得到时大约传了7－9代。 |) q4 U H. U4 o& [: U, A
4．J1rtTA-rtTA表达J1细胞，由Dr. Jaenish的实验室友情提供。
2 G- o H+ f/ z# |" \5．表达黄色荧光蛋白的YC5-ES细胞，由Dr. Nagy的实验室提供。2 D( }8 a, k& Q& j( N1 _. Q, _$ Y; Y
0 \7 F+ Q8 }+ e8 Z0 b一般培养--维持ES细胞处于未分化状态1 r) t( u6 ]& E( \+ {- X
ES细胞培养用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。& S; s; V0 H1 g
& m5 W( D# G5 s) A
培养基
1 n1 n" Q- b2 r3 F2 YES:
3 _$ r N- a+ r" Q) v# D# R2 d配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。分装在50ml FALCON管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和ESGRO加入450mlDMEM中制备培养基，0.2μm滤膜过滤。贮存于4℃。 注：一瓶DMEM是500ml。
- r7 {4 M# O# ]; L6 S1 s, U2 V- @& F% i a" \ t4 {% U7 n+ B( O0 L
贮存液
' c, x0 W5 P( a! |" JDMEM(高糖) 1 L3 x6 k$ f1 Q
马血清（HS） ' j* q. W+ Y- a; W! B3 k7 c# r
L-谷氨酰胺（200mM） * L: ^* ?' N1 V# L7 E5 x
MEM NEAA（10mM）
+ e0 U' c% @+ |HEPES（1M）
: d- q! A3 [# d' {β-巯基乙醇（55Mm） 6 j# a1 R* m% l% W5 c( S4 C
PEST # c9 x" E: Y* F! r* J N V
ESGRO
1 k7 ~3 L# {/ H9 n% [9 T" `7 t* T5 N+ A5 H" i! E: _8 |- ^! ]. v
复苏细胞
5 G# c3 `' {+ {+ P+ l* e8 i细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。
, n5 {7 n8 g6 M# h
, y& N9 r. _7 s S! y& j) [; a5 O m4 s: F
3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；9 b/ G; J8 \; C6 e5 f$ Y- d0 q
4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；4 z5 i, D' V$ h' p9 `" S+ } z
5．离心3分钟；
5 R% \! u. {! A9 o. }0 z: {6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；
5 i, q: B" r2 B5 ]0 z5 y# U7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿； l6 A* y/ [) i' D
8．孵育。 |
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发表于 2014-9-3 10:13
