Taqman探针法——PCR体系的建立

xiaolong523

1、引物、探针的设计：
8 ]6 l- m9 R  X, A, U: h      探针Tm为68-70℃ ，<30 bp, 5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，
7 U; Y7 Q: \6 ?8 h5 X0 _       引物尽量靠近探针，扩增片段<400 bp，引物Tm为59-60℃ 7 q7 [7 k6 ~- o" v8 V! z
, Y, j- j& T3 B: t, V
2、反应参数的确定：
$ O0 q* \/ ^3 b* n# Q4 }, @       一般为：94 ℃，10-20S1 k$ ]& j$ y  j7 w2 C- K
                        60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃ 最高），也可通过温度梯度优化退火温度
/ }4 h  w; o) L4 Z, k                     
; X6 z. e+ D$ m" `2 N. s6 r3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值
/ C! f2 @1 d  ^9 ~% [       引物浓度：50-900nM
- Z+ a2 g+ u2 ]1 M8 ^* W. ~       探针浓度：50-250nM
* }% }8 t6 q' Z, r3 e4 U/ |# `" L8 Q, p

Tlexander

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