脐带间充质干细胞爬不出来，求教！

chslyx

这段时间做的脐带都爬不出来细胞，请教一下原因
; I* }$ b8 a+ u1 q1、剪下来的脐带放在装有PBS（8万UI庆大）的瓶子里面通过血液运输箱拿回来，运输过程两小时左右{刚开始我以为PBS里面加的是双抗，后面问的装PBS的人才知道加的是庆大}$ Y, B. E! Z  y1 @' b: [
2、清洗：PBS----75%酒精一分钟------PBS----PBS, C) Z0 |! k- A1 k0 c* A
3、撕下动静脉，羊膜，剪碎，大约一小时（15cm脐带）2 `7 D+ o; p3 `) k. y) W  C. R
4、铺皿，用的是下面的培养基+12%FBS+20ng/mlEGF- [1 t4 ?. `/ o1 C! \5 A. u
37摄氏度，5%CO2培养8 H" E. \" F; ~9 {$ r
好几条都十多天还是没有出来细胞，请各位老师帮忙分析一下* [" M, o4 l: v

- x, u1 ]# l1 B) i- V9 P

yaolinzhang

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8 m; ?) x1 C+ E
1.运输时最好用培养基，尽量缩短时间；
$ L# F* O- y" n8 c: @6 P; N8 _( \2.用含双抗的PBS洗三遍即可，无需用75%的乙醇；
( h$ L6 X& N- d3.可以试试DMEM低糖培养基。% C) u; N, Q# M; G
注：尽量缩短组织及细胞在外界的暴露时间，祝好运

qiaozhong.9876

回复 yaolinzhang 的帖子5 P2 b$ a. C: T' a7 `% g

+ N9 M7 L" C- d, J& m  f! m1.运输时最好用加了双抗的M液，尽量把时间控制在48小时之内
: [$ L% e; O5 M/ z3 G2.操作过程没有多大问题，就是看你的图片，你剪的组织块比较大，剪的特别碎，最好是肉末状，整齐排在皿里，或者你用T75培养瓶养/ i2 `) f7 t% e0 e" u( `
3.把血清浓度调大按5:1的比例加
; e' [$ e; |$ }4.养脐带间充质干细胞加bFGF这种生长因子效果会更好
7 b$ N$ G* ~& l3 J5.你的培养基里应该再加一些丙酮酸钠

qiaozhong.9876

回复 qiaozhong.9876 的帖子0 i  Y- @8 R* @8 F
8 k  L8 R, O& V7 P' B, H, H
还有一点就是不知道你的血清是国产的还是进口的，用的是什么牌子的？0 P5 k) m* f( i, P3 Y2 X8 @6 L

chslyx

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% L5 x4 n- \  B7 T5 E7 b8 r3 K
1 V  `! j; d3 [- ]血清是gibco的，进口的

chslyx

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  [9 n% R) e8 o: g. H  K' B
0 g" g6 x  x3 l; \6 J运输时用培养基，那培养基里面要加血清和双抗吗？

yaolinzhang

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6 R/ V/ S/ F+ W7 L# r& m/ G6 A8 a3 O7 w
不用加血清，但要加双抗

听不到

我是觉得你剪碎的组织块排列的太密了，细胞没有空间长了。还有用乙醇处理我觉得对细胞也是有伤害的。不过我运输的时候整过直接就放在标本袋里，然后放在冰盒里带回来，然后用加双抗的PBS各种洗，也还挺好的，所以我不认为是你运输时使用液体的问题，不过得快，我基本都是在4个小时之内，一般2个小时就拿到操作了

chslyx

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% [' c; {9 t" G* Y6 ?6 f如果像我拍的那个培养皿的组织块的量，我可以分成两皿吗？

a52602589

第一 组织块太密集' h' s  n3 R2 S7 I+ }9 }) ], e% C
第二 建议更换培养瓶+ D2 v5 T  y& Y+ z9 G& a
第三 看培养基颜色太淡 是否加入培养基过少