小鼠iPS诱导靶细胞形态变化图，大家帮忙分析下是否正常

宋红卫song

病毒侵染2d后：4 n+ z; K4 A* k& h* p

# Y3 q+ s, K1 D. C5 ^& _& d, e# C$ _相应的pMX-GFP对照：1 T/ k) X9 O; k2 P/ K! Q3 t

) F/ \. [- I$ X7 [病毒侵染3d后：
$ r8 R8 D9 O9 d3 k1 `' E. M4 {8 v+ |  S0 S$ a9 r5 n
到病毒侵染4d时，将靶细胞接种到饲养层上。
! V2 M" t" l5 _/ \& G" _* Q0 m第9天细胞形态：
. y7 P9 v7 N- ^- p( u7 |/ ~2 q4 f! r- ?3 o* I

: h) y8 n1 w# O; R6 k正常来讲，四因子诱导第9天，应该出现mES样克隆。然而我发现克隆并非长得像典型的ES样，而是呈现不规则形、不够致密、细胞核清晰可见、边缘不清晰等。# g6 V* h. Y7 |* N  f
我用的是Oct4-EGFP鼠，第九天没看到绿色荧光。) [) f* [" r. n* Y
分析后，发现可能有以下原因：& Z* q) P2 i/ m# j( H
1、病毒量还不够，细胞诱导不充分，发生不完全重编程，类似克隆形状只是因为这些细胞分裂旺盛；
1 B. E, E# @- e1 N) D. P- V; s2、LIF失效。我用的LIF在4°C存放近一年，而有些克隆在边缘才出现核质比高、折射光强的细胞，可能因为LIF失效导致；# ~; P7 L3 _6 ^. d  C$ S3 j
3、本身小鼠四因子诱导在第九天时并不能观察到典型的ES样克隆，我观察的是正常现象，只需继续培养即可。, @* H0 i; l$ u/ x
4、其他原因。
) k, e2 m6 Z% d! v, j" }- g3 W: Q希望有相关经验的科研工作者为我解答一二，我观察的克隆形态是否正常，如果不正常，其可能的原因是什么？/ z: T; D* a8 ?; a" R9 ]0 T
/ V# }+ ^0 ~, }: G
补充内容 (2015-2-6 16:45):) K% }- `' d6 [. n% G1 t4 T
发帖时有些小错误：最后三张图中，前两张是pMX-GFP对照。最后一张是OSKM+miR-200c+miR-302诱导iPS

scottist

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& A3 g, Z. p$ e3 H
+ r& _2 w) l( i8 C+ G' a7 @9 Q, G从形态来看，你9天诱导后的克隆是非正常的，正常情况的话，9天的克隆应该是很漂亮的圆形克隆，细胞紧密排列，遮光性强，像一个金色的圆盘，周围还可能围绕一圈分化的细胞。个人猜测是你的慢病毒感染效率较低造成的不完全重编程。请确保慢病毒的滴度和活性后，再使用。

saifast00

我觉得9d时候克隆还可以挽救，再过两天看能不能变得致密一些？

sylar.wy

感觉抢救不了。。。第四天细胞才这么少？4因子细胞很多的: S2 ~; s( G+ I8 C/ j! p
小鼠做ips中途不用传到FEEDER也行吧
; J1 b$ l  _; v% N6 }4 S1 m
% X" A4 {4 N$ P1 ^1 i补充内容 (2015-2-10 14:05):; C% |; p  G4 N4 c3 G) p
第九天- -

宋红卫song

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4 ]& y8 o7 F) u! ~# G9 u
- ~9 N& F( N) l3 q嗯，感谢您的建议！

宋红卫song

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7 }! k' |( A" Q. F! M  U0 Z
2 f- e: W  _3 P0 }4 [0 w1 B" L嗯，目前正在观察。后来发现细胞间隙和细胞上附着很多黑点，有的地方还很密集，怀疑是支原体。不知您是否也遇到过类似的情况？

宋红卫song

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# @7 _, |& d* v- ?: y9 B& v
+ p6 b1 @+ j1 _8 F; E嗯，也有不转导feeder上的。下次分出一皿尝试一下

saifast00

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8 e7 o/ @, H% I$ L1 m( n5 S5 a- F9 Y
支原体如果不是非常严重理论上肉眼是不可见的，而且如果你们实验室不是常做原代培养，污染支原体的几率也不大

cloudycity

直接不用feeder也可以吧。你的估计是病毒滴度不够，效率不够高。

琴心杜若

本人新手，前辈进展如何？跪求指教