小鼠iPS诱导靶细胞形态变化图，大家帮忙分析下是否正常

宋红卫song

病毒侵染2d后：
/ ~8 P, |% T0 y& {" o, F3 v% P8 I, v, p2 ^
相应的pMX-GFP对照：% G; K; C  N2 _3 c

5 D6 V8 T" k% m. X$ w- l. Y) y病毒侵染3d后：$ W& }6 m  J( i$ e+ r

% f2 x$ A. @, G6 H# X! n6 F5 e5 r; z到病毒侵染4d时，将靶细胞接种到饲养层上。
4 ?  [9 @1 ]$ c6 Q! G- e8 \' ~第9天细胞形态：9 n. b3 d: \4 g) \+ k, X" |" \

, U* B5 U) y( n; E
9 G' R" r  `$ a正常来讲，四因子诱导第9天，应该出现mES样克隆。然而我发现克隆并非长得像典型的ES样，而是呈现不规则形、不够致密、细胞核清晰可见、边缘不清晰等。# g  ]& @9 y9 q+ ?* A+ Z" ~6 s
我用的是Oct4-EGFP鼠，第九天没看到绿色荧光。
, E) F; q. U, A' x& }分析后，发现可能有以下原因：6 L1 T, v: T5 f) m
1、病毒量还不够，细胞诱导不充分，发生不完全重编程，类似克隆形状只是因为这些细胞分裂旺盛；
8 @9 J- F0 |8 [1 I2、LIF失效。我用的LIF在4°C存放近一年，而有些克隆在边缘才出现核质比高、折射光强的细胞，可能因为LIF失效导致；
; F( \: P3 v4 U, @2 W8 Y3、本身小鼠四因子诱导在第九天时并不能观察到典型的ES样克隆，我观察的是正常现象，只需继续培养即可。
3 c  M2 o1 G9 w. N3 D1 ?. B4、其他原因。
  o) p1 g9 I5 b希望有相关经验的科研工作者为我解答一二，我观察的克隆形态是否正常，如果不正常，其可能的原因是什么？: C) ~% f' v- ]; e

( u* }; e: |$ ^. |6 Q" E  j# S补充内容 (2015-2-6 16:45):" a/ p' L# \( Q+ P# h2 l6 A' M
发帖时有些小错误：最后三张图中，前两张是pMX-GFP对照。最后一张是OSKM+miR-200c+miR-302诱导iPS

scottist

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) X. G8 \& N+ W0 M* F+ J
% t1 \; E: @$ K* u/ V从形态来看，你9天诱导后的克隆是非正常的，正常情况的话，9天的克隆应该是很漂亮的圆形克隆，细胞紧密排列，遮光性强，像一个金色的圆盘，周围还可能围绕一圈分化的细胞。个人猜测是你的慢病毒感染效率较低造成的不完全重编程。请确保慢病毒的滴度和活性后，再使用。

saifast00

我觉得9d时候克隆还可以挽救，再过两天看能不能变得致密一些？

sylar.wy

感觉抢救不了。。。第四天细胞才这么少？4因子细胞很多的! y7 X! T- j/ I
小鼠做ips中途不用传到FEEDER也行吧& }8 y* w. s, k0 l

0 m% I/ `8 R. X. j  a补充内容 (2015-2-10 14:05):% Z' J) y5 q3 z. d' P, l2 p! i
第九天- -

宋红卫song

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3 J6 E+ t+ g9 u
2 A" v+ u' X" I3 I& B( C- \$ y嗯，感谢您的建议！

宋红卫song

回复 saifast00 的帖子% Z2 }/ l. ~" y# r

: p& s5 A  a' Y嗯，目前正在观察。后来发现细胞间隙和细胞上附着很多黑点，有的地方还很密集，怀疑是支原体。不知您是否也遇到过类似的情况？

宋红卫song

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5 ]/ x0 F# P% ]3 k% r+ r/ H" R+ x3 l( O# M% {, l0 w" b9 c
嗯，也有不转导feeder上的。下次分出一皿尝试一下

saifast00

回复 宋红卫song 的帖子3 i$ c; N& o2 Q+ E

# M& R. ^0 z- L' f! ?9 S9 r支原体如果不是非常严重理论上肉眼是不可见的，而且如果你们实验室不是常做原代培养，污染支原体的几率也不大

cloudycity

直接不用feeder也可以吧。你的估计是病毒滴度不够，效率不够高。

琴心杜若

本人新手，前辈进展如何？跪求指教