小鼠iPS诱导靶细胞形态变化图，大家帮忙分析下是否正常

宋红卫song

病毒侵染2d后：
4 X7 {8 ~7 Y, s  v/ J5 p) n' _6 s0 e3 O' p% W' s
相应的pMX-GFP对照：
! Z4 _, A$ H4 {8 U% I  Y) o( b
5 {; A2 n8 }  ?2 ~6 P; d病毒侵染3d后：( I3 U( g5 M: {+ D, E" L3 a

+ [7 k, L+ O8 p- k. U/ H1 t到病毒侵染4d时，将靶细胞接种到饲养层上。
4 j9 g  w4 ^% {5 H+ j# o第9天细胞形态：( D% Z& c, c( }  ]0 o1 w
' f6 l0 C! ]- }( L
+ M6 J" r2 ^! m& Y/ d
正常来讲，四因子诱导第9天，应该出现mES样克隆。然而我发现克隆并非长得像典型的ES样，而是呈现不规则形、不够致密、细胞核清晰可见、边缘不清晰等。
, E$ a, I! Z, N+ Y( t我用的是Oct4-EGFP鼠，第九天没看到绿色荧光。5 J' m. X0 Y0 U; o
分析后，发现可能有以下原因：' d6 w7 m7 V+ u1 {+ C3 B! ]
1、病毒量还不够，细胞诱导不充分，发生不完全重编程，类似克隆形状只是因为这些细胞分裂旺盛；, B2 f- d6 D$ X" ?  U3 H
2、LIF失效。我用的LIF在4°C存放近一年，而有些克隆在边缘才出现核质比高、折射光强的细胞，可能因为LIF失效导致；' Z  K" X, j6 F8 p! s' C' g
3、本身小鼠四因子诱导在第九天时并不能观察到典型的ES样克隆，我观察的是正常现象，只需继续培养即可。
8 |9 q! [$ s0 i: s* O, V8 J4、其他原因。
2 R- z4 {. T9 D8 u+ d) K7 F% ?) ?( v希望有相关经验的科研工作者为我解答一二，我观察的克隆形态是否正常，如果不正常，其可能的原因是什么？3 D' K: K' ^/ Z' }: J( A8 B
  L/ _+ E- g; i: H# b: A+ t
补充内容 (2015-2-6 16:45):
& ^5 S! q5 w. H/ O* X发帖时有些小错误：最后三张图中，前两张是pMX-GFP对照。最后一张是OSKM+miR-200c+miR-302诱导iPS

scottist

回复 宋红卫song 的帖子( H3 X; e/ Y3 `" L# c* D" Y

0 A! G0 m; L/ ]: R从形态来看，你9天诱导后的克隆是非正常的，正常情况的话，9天的克隆应该是很漂亮的圆形克隆，细胞紧密排列，遮光性强，像一个金色的圆盘，周围还可能围绕一圈分化的细胞。个人猜测是你的慢病毒感染效率较低造成的不完全重编程。请确保慢病毒的滴度和活性后，再使用。

saifast00

我觉得9d时候克隆还可以挽救，再过两天看能不能变得致密一些？

sylar.wy

感觉抢救不了。。。第四天细胞才这么少？4因子细胞很多的9 Q3 l+ Z& K9 c% ?+ \! M  `/ R  Y% u
小鼠做ips中途不用传到FEEDER也行吧
6 o4 `6 r. N9 ]. j  t( b9 I* J3 _# k& z
补充内容 (2015-2-10 14:05):
8 Y* n1 @  h9 P& M7 `第九天- -

宋红卫song

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% d+ H" y. ^4 @9 }2 l, U; K" y% ?
( q  D3 i8 S6 y0 v8 _2 F- C嗯，感谢您的建议！

宋红卫song

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! o! a0 M, Q! ]4 y% A& E' \
% }. l. }% X  a( U  E& d) r嗯，目前正在观察。后来发现细胞间隙和细胞上附着很多黑点，有的地方还很密集，怀疑是支原体。不知您是否也遇到过类似的情况？

宋红卫song

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0 i6 l$ t+ |$ d7 ~3 l& S& d$ n; [, c, G/ T
嗯，也有不转导feeder上的。下次分出一皿尝试一下

saifast00

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# _  }6 T& m& w- J9 L6 l. d4 J" v( v
支原体如果不是非常严重理论上肉眼是不可见的，而且如果你们实验室不是常做原代培养，污染支原体的几率也不大

cloudycity

直接不用feeder也可以吧。你的估计是病毒滴度不够，效率不够高。

琴心杜若

本人新手，前辈进展如何？跪求指教