小鼠iPS诱导靶细胞形态变化图，大家帮忙分析下是否正常

宋红卫song

病毒侵染2d后：
5 ~7 f, @( E, G* Y4 n9 G2 `
" Z. m4 I+ R# b9 Q7 x相应的pMX-GFP对照：
5 ]0 h7 r- F, u! d( s
6 M- T' H$ i" _, {% J7 h1 J# b病毒侵染3d后：; Z' ~; S1 c0 x
2 {% e* p* i0 E1 e" C' j
到病毒侵染4d时，将靶细胞接种到饲养层上。3 K8 v! i3 x- n% X4 s" a* u/ n2 \
第9天细胞形态：' a8 c* S  ]- J0 z# P2 c

$ I* G3 q. K# o" h, |$ I) u3 `% \. U# N
正常来讲，四因子诱导第9天，应该出现mES样克隆。然而我发现克隆并非长得像典型的ES样，而是呈现不规则形、不够致密、细胞核清晰可见、边缘不清晰等。
) l! J. W* b' _: n2 K0 Z我用的是Oct4-EGFP鼠，第九天没看到绿色荧光。
3 V4 G) l1 E1 j  i  X0 g分析后，发现可能有以下原因：3 X# R, k; i2 x% l
1、病毒量还不够，细胞诱导不充分，发生不完全重编程，类似克隆形状只是因为这些细胞分裂旺盛；3 l! l. q- }0 ^6 f& r
2、LIF失效。我用的LIF在4°C存放近一年，而有些克隆在边缘才出现核质比高、折射光强的细胞，可能因为LIF失效导致；6 U1 I9 Z" c# l- i# @4 \
3、本身小鼠四因子诱导在第九天时并不能观察到典型的ES样克隆，我观察的是正常现象，只需继续培养即可。8 ?) @* M. p4 Y2 |  E
4、其他原因。
2 h- Q: G. a( [希望有相关经验的科研工作者为我解答一二，我观察的克隆形态是否正常，如果不正常，其可能的原因是什么？
; F: b: q. v. w+ Z) S+ M5 Q( C+ A5 t2 Y9 E7 X
补充内容 (2015-2-6 16:45):
. C0 Z1 ]9 m6 T( A" q发帖时有些小错误：最后三张图中，前两张是pMX-GFP对照。最后一张是OSKM+miR-200c+miR-302诱导iPS

scottist

回复 宋红卫song 的帖子8 s/ s4 Q- V$ l- z) H5 A

) M6 `9 a; v0 x. Z& }% T% k: k从形态来看，你9天诱导后的克隆是非正常的，正常情况的话，9天的克隆应该是很漂亮的圆形克隆，细胞紧密排列，遮光性强，像一个金色的圆盘，周围还可能围绕一圈分化的细胞。个人猜测是你的慢病毒感染效率较低造成的不完全重编程。请确保慢病毒的滴度和活性后，再使用。

saifast00

我觉得9d时候克隆还可以挽救，再过两天看能不能变得致密一些？

sylar.wy

感觉抢救不了。。。第四天细胞才这么少？4因子细胞很多的
. [/ n4 y* |. \0 Y小鼠做ips中途不用传到FEEDER也行吧
9 J7 _* L  H. J% Q6 J' H- m" p4 d
补充内容 (2015-2-10 14:05):$ S! ^: U( J9 f: m# p# K" K
第九天- -

宋红卫song

回复 scottist 的帖子
, H2 R+ E' s) g  K+ b5 ^; U$ `7 |* \
嗯，感谢您的建议！

宋红卫song

回复 saifast00 的帖子
1 C" D5 r1 U; h, F) a) E# ?: r
; S* C, i0 ]2 @8 F  \) @嗯，目前正在观察。后来发现细胞间隙和细胞上附着很多黑点，有的地方还很密集，怀疑是支原体。不知您是否也遇到过类似的情况？

宋红卫song

回复 sylar.wy 的帖子
0 u' B& H: u2 H" u
- h9 a! C2 T/ C" k嗯，也有不转导feeder上的。下次分出一皿尝试一下

saifast00

回复 宋红卫song 的帖子
7 g0 Q: p/ ^6 r/ p. j' _+ g* t7 i) G: b  W
支原体如果不是非常严重理论上肉眼是不可见的，而且如果你们实验室不是常做原代培养，污染支原体的几率也不大

cloudycity

直接不用feeder也可以吧。你的估计是病毒滴度不够，效率不够高。

琴心杜若

本人新手，前辈进展如何？跪求指教