小鼠iPS诱导靶细胞形态变化图，大家帮忙分析下是否正常

宋红卫song

病毒侵染2d后：
2 d- L7 |1 K! N+ n# b! V0 M  i1 n% J- C9 a' W) i
相应的pMX-GFP对照：5 d/ X4 e8 A( v) l6 m+ l
  r0 M+ `* [: ~
病毒侵染3d后：
$ y- R: V. m% T- w6 }7 ?5 n' _7 \
到病毒侵染4d时，将靶细胞接种到饲养层上。% n9 P7 u5 t. U; F5 L
第9天细胞形态：, T5 L/ j# q5 |9 j
! W8 f2 |: y! ]

# C$ C5 e$ j  O5 g9 o正常来讲，四因子诱导第9天，应该出现mES样克隆。然而我发现克隆并非长得像典型的ES样，而是呈现不规则形、不够致密、细胞核清晰可见、边缘不清晰等。: E# P3 i" ~# ]
我用的是Oct4-EGFP鼠，第九天没看到绿色荧光。- k# B# C# `; z7 s2 R
分析后，发现可能有以下原因：+ j+ {9 R" S, h$ I5 ?, ?
1、病毒量还不够，细胞诱导不充分，发生不完全重编程，类似克隆形状只是因为这些细胞分裂旺盛；, j. a/ X* i( R( p! d1 L
2、LIF失效。我用的LIF在4°C存放近一年，而有些克隆在边缘才出现核质比高、折射光强的细胞，可能因为LIF失效导致；
# G$ G3 [# B' c# b* K3、本身小鼠四因子诱导在第九天时并不能观察到典型的ES样克隆，我观察的是正常现象，只需继续培养即可。$ G- h+ ?) f( r! o/ _
4、其他原因。
$ q7 A8 k0 l, @- V5 m% @希望有相关经验的科研工作者为我解答一二，我观察的克隆形态是否正常，如果不正常，其可能的原因是什么？) T6 ~0 m4 u( c$ m/ _
" c' j9 p/ d) u9 j& v7 }
补充内容 (2015-2-6 16:45):% D& B2 t' G, p) r9 V
发帖时有些小错误：最后三张图中，前两张是pMX-GFP对照。最后一张是OSKM+miR-200c+miR-302诱导iPS

scottist

回复 宋红卫song 的帖子
& y' _/ L% `: ?' N7 G4 H
- q$ V& V: d# k$ g& r从形态来看，你9天诱导后的克隆是非正常的，正常情况的话，9天的克隆应该是很漂亮的圆形克隆，细胞紧密排列，遮光性强，像一个金色的圆盘，周围还可能围绕一圈分化的细胞。个人猜测是你的慢病毒感染效率较低造成的不完全重编程。请确保慢病毒的滴度和活性后，再使用。

saifast00

我觉得9d时候克隆还可以挽救，再过两天看能不能变得致密一些？

sylar.wy

感觉抢救不了。。。第四天细胞才这么少？4因子细胞很多的
  f4 Y% p7 p$ n5 h) D3 ?% g3 Z小鼠做ips中途不用传到FEEDER也行吧) f6 g0 R2 V0 A. s

" P& k! S/ m3 N补充内容 (2015-2-10 14:05):
( ~0 t4 b4 E2 S$ m第九天- -

宋红卫song

回复 scottist 的帖子
. l- Y& r" g* R* `% P0 Q4 R' x* x' q
1 i) H  F  p2 n+ X* ?5 p- Q嗯，感谢您的建议！

宋红卫song

回复 saifast00 的帖子
* i" v5 c* H+ R$ L& k8 o% I, k( x8 ?% ]+ d5 u$ y9 t( x
嗯，目前正在观察。后来发现细胞间隙和细胞上附着很多黑点，有的地方还很密集，怀疑是支原体。不知您是否也遇到过类似的情况？

宋红卫song

回复 sylar.wy 的帖子* T+ \2 v6 U* y- f- f) O+ @, A

4 Z; y  p$ c, r) t嗯，也有不转导feeder上的。下次分出一皿尝试一下

saifast00

回复 宋红卫song 的帖子" d# f0 L; B: r' W

, L  o% \+ q4 U! Y& V支原体如果不是非常严重理论上肉眼是不可见的，而且如果你们实验室不是常做原代培养，污染支原体的几率也不大

cloudycity

直接不用feeder也可以吧。你的估计是病毒滴度不够，效率不够高。

琴心杜若

本人新手，前辈进展如何？跪求指教