鸡精原干细胞的免疫组化染色（培养板中染色）

梦茹

免疫组化染色（培养板中染色）
% @( V1 ?3 y0 F! o: Y+ ^4 r; Q2 Z: G/ R1 培养的干细胞集落，弃去培养基，冷的PBS洗两次，首先用4%多聚甲醛（4孔板200μl）固定10min，PBS洗2次，每次5－10分钟。
" n+ s. w+ K: ^6 E# C2 在含0.1% Triton X-100（4孔板200μl）的PBS中进行10min的透膜处理，PBS洗2次，每次5-10分钟。手动轻轻晃动数次，吸尽液体。
* A: z5 F8 R6 c- R8 {6 }3羊血清用PBS配制成4％羊血清封闭液，室温封闭（4孔板200μl）30分钟。  ?5 {1 P% _3 \) O  D
4用封闭液稀释一抗到工作浓度（1：20），去封闭液，勿洗，添加一抗（4孔板50μl），于37℃条件下孵育1h或放在4℃冰箱过夜，PBS洗3次，每次5-10分钟。（同时设一孔不添加一抗作对照）  G3 d7 w6 b5 l( }3 h2 B& {
5去掉一抗后，细胞用PBS洗三次。同时用PBS稀释二抗（1：200），然后加入相对应的孔（4孔板200μl），在室温条件下作用30-60min。PBS洗3次，每次5-10分钟，最后留少量PBS。同时采用不添加一抗，而仅添加二抗的细胞作为阴性对照组，检测二抗的非特异性结合能力。
- X& q8 L$ @8 i6免疫标记过的细胞通过荧光显微镜进行检测拍照。
% U) X; I' X6 p: u0 o, x& A
7 {9 {% Z0 O2 z9 C8 i) E6 C（可最后添加10μg/ml的PI染细胞核5分钟，PBS洗2次）3 Q4 b) p6 @3 D7 K
SSEA-1, TRA-1-60，TRA-1-81为IgM ；SSEA-4为IgG，注意添加相应二抗6 a7 D" }, ]6 P2 w) |7 B- W; T

: \" f5 J& ?3 e* j& ^" S5 w所需溶液：
6 T$ t! e1 ], k, l  ~) G/ s4%多聚甲醛、0.1% Triton X-100/PBS、4％羊血清封闭液/ PBS. I1 ?3 v% i$ e$ p0 f! a1 W% Y
; N+ D: c. X% u" a" }3 ?
问题向导 ：
# U. I1 `( P5 \5 _1 M•  染色过深：
; ^3 U* h, e; B9 J9 ^% W. l⑴ 一抗浓度过高或孵育时间太长； ⑵ 孵育温度过高。
: j" ~$ ]' n1 `* d9 O+ i•  非特异性背景着色：
) w+ E  p$ R: I' ?& E⑴ 缓冲液冲洗不充分； ⑵ 操作过程中组织切片干片； ⑶ 操作过程中组织发生折叠；( g1 C$ i1 l3 _* g8 ]' V
⑷ 组织中包含内源性的过氧化物酶； ⑸ 抗原扩散； ⑹ 多余的组织粘附在组织切片上； ⑺ 蛋白阻断剂阻断不充分。
) L. {- l7 n' ~5 i! N•  染色过浅 ：, a8 I5 d: h0 j  y# k  b
⑴ 一抗浓度太低或孵育时间太短； ⑵ 试剂已经降解； ⑶ 操作过程中缓冲液冲洗后残留过多，导致试剂被稀释； ⑷ 复染或封片剂不相配，色素反应产物被溶解；