鸡精原干细胞的免疫组化染色（培养板中染色）

梦茹

免疫组化染色（培养板中染色）( j( U: U% W' A# v& A& [; v
1 培养的干细胞集落，弃去培养基，冷的PBS洗两次，首先用4%多聚甲醛（4孔板200μl）固定10min，PBS洗2次，每次5－10分钟。6 r' q& f) q" I
2 在含0.1% Triton X-100（4孔板200μl）的PBS中进行10min的透膜处理，PBS洗2次，每次5-10分钟。手动轻轻晃动数次，吸尽液体。3 U1 K7 Q: x3 ^) v8 L  z
3羊血清用PBS配制成4％羊血清封闭液，室温封闭（4孔板200μl）30分钟。
7 \8 J7 [& i3 M$ i! R4用封闭液稀释一抗到工作浓度（1：20），去封闭液，勿洗，添加一抗（4孔板50μl），于37℃条件下孵育1h或放在4℃冰箱过夜，PBS洗3次，每次5-10分钟。（同时设一孔不添加一抗作对照）0 ^/ ~% m2 o5 ^. ^
5去掉一抗后，细胞用PBS洗三次。同时用PBS稀释二抗（1：200），然后加入相对应的孔（4孔板200μl），在室温条件下作用30-60min。PBS洗3次，每次5-10分钟，最后留少量PBS。同时采用不添加一抗，而仅添加二抗的细胞作为阴性对照组，检测二抗的非特异性结合能力。0 ]6 \5 m- r0 k! K8 Z8 v( v
6免疫标记过的细胞通过荧光显微镜进行检测拍照。" f) |( }& W9 A/ A. v# d
1 D" p1 `) F5 A6 b+ s) g* |$ B; a
（可最后添加10μg/ml的PI染细胞核5分钟，PBS洗2次）8 Y0 ]6 l5 u* l4 ]* D* @( E
SSEA-1, TRA-1-60，TRA-1-81为IgM ；SSEA-4为IgG，注意添加相应二抗: ^6 h4 @6 t; X
7 ~6 o% o1 I0 m5 E8 {! t8 j
所需溶液：& f: B* B5 j% A
4%多聚甲醛、0.1% Triton X-100/PBS、4％羊血清封闭液/ PBS
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; z9 i5 J" E* A8 K. K; \问题向导 ： + w7 _( o; y: j% A9 E
•  染色过深：
5 D+ n% B2 F+ |) J6 q( D" s⑴ 一抗浓度过高或孵育时间太长； ⑵ 孵育温度过高。: z+ B) D3 q" O! l  E
•  非特异性背景着色：
0 \% }& i6 ]7 \( n9 w0 v& Q⑴ 缓冲液冲洗不充分； ⑵ 操作过程中组织切片干片； ⑶ 操作过程中组织发生折叠；  {8 q) O8 `# c+ o) V
⑷ 组织中包含内源性的过氧化物酶； ⑸ 抗原扩散； ⑹ 多余的组织粘附在组织切片上； ⑺ 蛋白阻断剂阻断不充分。
" f5 {1 h% U# M3 i7 A  f6 H, z•  染色过浅 ：6 h( k4 i8 O( j. P5 h
⑴ 一抗浓度太低或孵育时间太短； ⑵ 试剂已经降解； ⑶ 操作过程中缓冲液冲洗后残留过多，导致试剂被稀释； ⑷ 复染或封片剂不相配，色素反应产物被溶解；