CIK细胞的制备方法 - 免疫细胞治疗专区干细胞之家



免疫细胞治疗专区	欢迎关注干细胞微信公众号

返回列表

查看: 30585\|回复: 9	go CIK细胞的制备方法 [复制链接]

gygy

新手上路

Rank: 1

积分: 4
威望: 4
包包: 46

楼主

发表于 2015-3-3 19:37 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

【背景】CIK是“Cytokine-Induced Killer Cells”的缩写，中文全称为“细胞因子诱导的杀伤细胞”。  CIK是单个核细胞在CD3单抗和多种细胞因子(包括IFN-g,  IL-2等)的作用下培养获得的一群以CD3+CD56+细胞为主要效应细胞的异质细胞群，  其既具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，又具有NK细胞(自然杀伤细胞)的非MHC(主要组织相容性抗原)限制性肿瘤杀伤能力。CIK细胞具有杀瘤活性高、杀瘤谱广，对正常组织毒性低，体外可高度扩增等特点，是目前临床上广泛使用的过继性免疫治疗细胞。5 V; d7 V9 Y) f& @

【培养原理】2 ]4 P. P& B" c3 C+ }
CIK培养用细胞因子和抗体：- V3 ~- K, d; x: H
n
CD3激发型单抗：
T细胞活化的第一信号来自于T细胞表面的受体，即T细胞抗原受体(T cell antigen receptor,  TCR)与APC提呈的抗原的特异性结合，也就是T细胞对抗原的特异性识别。TCR是由2条不同肽链构成的异二聚体，在T细胞表面，其与CD3分子通过非共价键结合，形成TCR/CD3复合体。TCR识别特异性抗原后会引起CD3和T细胞表面的辅助受体CD4或CD8分子的胞浆尾部聚集，进而激活与胞浆尾部相连的酪氨酸激酶(Lck,  Fyn和ZAP-70等)，促使CD3分子胞浆区的免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based  activation motif,  ITAM)中的酪氨酸(Y)磷酸化。磷酸化的酪氨酸(pY)进一步磷酸化下游含酪氨酸的蛋白，从而引起激酶活化的级联反应(磷脂酰肌醇途径或MAP激酶途径等)，最终通过激活转录因子，使其进入细胞核内，结合于调控T细胞增殖和活化的靶基因(如IL-2和IFN-g等)，引起基因的表达和转录，T细胞因而由静止状态转为增殖和活化状态。3 A1 j, ~. L3 m( M9 l9 b; Z; k
* K/ k0 n% s5 c) m
由上可见，CD3分子在T细胞活化信号的转导中起着极其关键的作用。CD3激发型单抗与T细胞表面CD3分子特异性结合后，可引起CD3分子胞浆区ITAM基序中酪氨酸的磷酸化，进而导致T细胞增殖和活化的下游信号的激活，从而使T细胞增殖和活化。也就是说，CD3激发型单抗能够模拟抗原与TCR/CD3复合物的识别和激活过程，从而引起T细胞的增殖与活化，因此是CIK细胞培养中不可或缺的刺激因素。
4 b# N3 a- k$ X9 L! p
此外，CD3激发型单抗在选用时一定要注意克隆号。研究表明，仅克隆号为OKT-3的CD3激发型单抗可以刺激所有人的T细胞的增殖，而其它克隆号的CD3激发型单抗仅能刺激一部分人的T细胞。因此，在进行CIK培养时，最好选用OKT-3克隆，以保证每个患者的T细胞均能被激活。( S, b8 L( V: p, x; a. E# `
3 ^7 h+ Q, i- }4 ?( r: ]
n! n" N; |! u4 }, b
IL-2 (白细胞介素-2)
  IL-2最初发现时被称为T细胞生长因子(T cell growth factor,  TCGF)，是引起T细胞增殖最重要的细胞因子。IL-2既是自分泌细胞因子，也是旁分泌细胞因子，其通过与T细胞表面的IL-2受体(IL-2R)的特异性结合而促使T细胞活化，并进入细胞分裂状态。此外，IL-2还可刺激NK细胞的生长并增强其杀伤能力。因此CIK细胞培养中须添加IL-2，以促进T细胞的增殖与活化。

n
IFN-g (干扰素-g)5 y, x) ~8 N$ V# h
  IFN-g  具有上调外周血淋巴细胞表面IL-2R表达的作用，因此会增强T细胞对IL-2促增殖反应的敏感度和强度。在诱导CIK细胞形成的过程中加入IFN-  g ，可降低IL-2的用量。研究发现，IFN-g加入的顺序与CIK的细胞毒活性密切相关。先加入IFN-  g，培养24后再加入IL-2，可明显提高CIK的细胞毒活性。
& o& K" E( z7 S" x# }  K5 v
n
IL-1a(白细胞介素-1a)6 n: N3 }* X' Z4 R/ R
  IL-1a也可以介导外周血淋巴细胞表面上调表达IL-2R。当IL-1a与IFN-g和激发型CD3单抗合用时，可以明显提高CIK  的细胞毒作用。; o; p! q0 ~7 s6 c3 e/ Q
/ g  J4 [2 m6 Z# d9 n4 g) s
【细胞制备】
1．' {* H. a1 k) ~8 q6 z+ M
外周血单个核细胞的采集
1.1
用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞50-100mL；9 ~+ E$ ^# Z, J. p! |. D
1.2
淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC)；+ }# M4 r5 j1 K$ N6 O# ?! T
1.3* n" ~% H( K7 m6 `5 P
无血清培养液洗涤2次，获得纯度在90%以上的PBMC。/ z0 I5 p1 `: R6 I! b3 R: ~
! r# m  f, h4 \! C* K! y' a6 S
2．+ h; Q% P! Z9 @( f
CIK细胞的培养及鉴定+ @, j9 Y' V: P2 l& Q9 p' ^
2.1% C1 m5 A1 s& R' V
将PBMC按1-2 x  106/ml的浓度悬浮于无血清培养液中，加入1,000 U/ml 的重组人IFN-g，37oC，5%CO2培养箱中培养；( A( f$ M* F9 ?9 {+ e6 ?  Y6 v
2.20 K: L# _$ s' U+ J  w1 l
24h 后加入50ng/ml 的CD3 单克隆抗体和300 U/ml  的重组人IL-2，刺激CIK 细胞的生长和增殖；
  注：此时也可同时加入100 U/ml的重组人IL-1a。
2.30 s0 Q: r' [# O5 E3 @
每3天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人IL-2 300 U/ml；
2.4- ^" i& S* h% }6 C; L
在培养的第14d，收获CIK细胞。4 f8 R! N5 Y; i% r
2.5
CIK细胞质控：
2.9.1' ]5 v  r6 `: K& [! U! w
台盼蓝染色检测：活细胞应在80%以上；8 w: B2 w" \6 e8 e: q
2.9.2  h  r$ l/ W6 o, @' h* t
流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表达：CD3+CD56+细胞的比例应在20%以上。6 J/ T7 H2 I& |- T% Y
2.9.3& r6 U0 _+ x( I& e- c9 q7 \
细胞杀伤实验：以CIK细胞为效应细胞，以肿瘤细胞(可为原代肿瘤细胞或肿瘤细胞株)为靶细胞，将效应细胞与靶细胞按10  : 1(数目比) 的比例加入96 孔U 型板中，每孔含靶细胞1 x 104个，终体积为200  ml，设3个复孔。培养4h，然后取培养上清，用乳酸脱氢酶(LDH) 试剂盒检测效应细胞对靶细胞的杀伤率。4 u. G8 z# S* s  {) i: Q% ?  n; D# f3 Z
2.9.43 {  L' i+ Z# ]1 z
收获细胞前，取少量培养物进行细菌、真菌培养，并检测支原体、衣原体，及内毒素(标准：病原学检测阴性，内毒素<5  Eu)。

【步骤简图】* v, b) p: _$ o# v" N3 a

0 ~9 D8 |' \' Q' `/ k+ I) P9 h5 ^( g+ s