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【背景】CIK是“Cytokine-Induced Killer Cells”的缩写，中文全称为“细胞因子诱导的杀伤细胞”。 CIK是单个核细胞在CD3单抗和多种细胞因子(包括IFN-g, IL-2等)的作用下培养获得的一群以CD3+CD56+细胞为主要效应细胞的异质细胞群， 其既具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，又具有NK细胞(自然杀伤细胞)的非MHC(主要组织相容性抗原)限制性肿瘤杀伤能力。CIK细胞具有杀瘤活性高、杀瘤谱广，对正常组织毒性低，体外可高度扩增等特点，是目前临床上广泛使用的过继性免疫治疗细胞。
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9 }: B; N; A7 ]4 e; Y【培养原理】* ] P/ C; h z* K3 n1 n6 J
CIK培养用细胞因子和抗体：
3 Z9 ^1 B- B( T1 e' B- V2 kn/ \1 ]: k5 ~) G# R% |
CD3激发型单抗：
! m' u* M- g% j" Y9 A- YT细胞活化的第一信号来自于T细胞表面的受体，即T细胞抗原受体(T cell antigen receptor, TCR)与APC提呈的抗原的特异性结合，也就是T细胞对抗原的特异性识别。TCR是由2条不同肽链构成的异二聚体，在T细胞表面，其与CD3分子通过非共价键结合，形成TCR/CD3复合体。TCR识别特异性抗原后会引起CD3和T细胞表面的辅助受体CD4或CD8分子的胞浆尾部聚集，进而激活与胞浆尾部相连的酪氨酸激酶(Lck, Fyn和ZAP-70等)，促使CD3分子胞浆区的免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)中的酪氨酸(Y)磷酸化。磷酸化的酪氨酸(pY)进一步磷酸化下游含酪氨酸的蛋白，从而引起激酶活化的级联反应(磷脂酰肌醇途径或MAP激酶途径等)，最终通过激活转录因子，使其进入细胞核内，结合于调控T细胞增殖和活化的靶基因(如IL-2和IFN-g等)，引起基因的表达和转录，T细胞因而由静止状态转为增殖和活化状态。( ~8 V* m6 m, ?( i/ i$ Z, R
1 c c) u, y5 v7 V1 \1 P. y, i7 y由上可见，CD3分子在T细胞活化信号的转导中起着极其关键的作用。CD3激发型单抗与T细胞表面CD3分子特异性结合后，可引起CD3分子胞浆区ITAM基序中酪氨酸的磷酸化，进而导致T细胞增殖和活化的下游信号的激活，从而使T细胞增殖和活化。也就是说，CD3激发型单抗能够模拟抗原与TCR/CD3复合物的识别和激活过程，从而引起T细胞的增殖与活化，因此是CIK细胞培养中不可或缺的刺激因素。; a5 I1 X' I5 g5 ?6 g
) I# d' y% U# G此外，CD3激发型单抗在选用时一定要注意克隆号。研究表明，仅克隆号为OKT-3的CD3激发型单抗可以刺激所有人的T细胞的增殖，而其它克隆号的CD3激发型单抗仅能刺激一部分人的T细胞。因此，在进行CIK培养时，最好选用OKT-3克隆，以保证每个患者的T细胞均能被激活。' q; y. e+ t9 E: w k z0 C
2 h4 ^0 y# n$ o6 J* `/ H; ]n$ T4 n4 E. x. D
IL-2 (白细胞介素-2)
1 z! l0 @: A/ [1 a1 u' A IL-2最初发现时被称为T细胞生长因子(T cell growth factor, TCGF)，是引起T细胞增殖最重要的细胞因子。IL-2既是自分泌细胞因子，也是旁分泌细胞因子，其通过与T细胞表面的IL-2受体(IL-2R)的特异性结合而促使T细胞活化，并进入细胞分裂状态。此外，IL-2还可刺激NK细胞的生长并增强其杀伤能力。因此CIK细胞培养中须添加IL-2，以促进T细胞的增殖与活化。% N( O% b3 ?: ~: W% K* v6 B% e
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IFN-g (干扰素-g)
7 h3 m' `0 t. m0 ` W& x8 k1 R! A! N: D IFN-g 具有上调外周血淋巴细胞表面IL-2R表达的作用，因此会增强T细胞对IL-2促增殖反应的敏感度和强度。在诱导CIK细胞形成的过程中加入IFN- g ，可降低IL-2的用量。研究发现，IFN-g加入的顺序与CIK的细胞毒活性密切相关。先加入IFN- g，培养24后再加入IL-2，可明显提高CIK的细胞毒活性。
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IL-1a(白细胞介素-1a)2 `6 ^: Z7 P6 _( }/ a
IL-1a也可以介导外周血淋巴细胞表面上调表达IL-2R。当IL-1a与IFN-g和激发型CD3单抗合用时，可以明显提高CIK 的细胞毒作用。
0 N3 s1 [6 \4 q 4 P1 z8 L2 O) ?5 Z) Y B
【细胞制备】. k* _( M1 y9 n, \
1．
) F7 O! e3 ^8 k1 Z% f* m% k7 S: K外周血单个核细胞的采集 L6 p- Z5 S6 \7 ^- L. z
1.1, C3 r" I K! N3 c! o
用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞50-100mL；
7 W" P" x5 R4 e8 Q) y1.2
: }9 Z9 V/ E2 x$ l2 [淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC)；: e3 P4 J' w9 Y7 F
1.3
) F2 z; t$ d, T* n& i8 a1 I9 ^无血清培养液洗涤2次，获得纯度在90%以上的PBMC。
, U& w- m: u. o! ]" d: Q- H # `7 @/ k- G3 M) ?
2．
. B9 B$ r$ n4 _5 xCIK细胞的培养及鉴定
2 Z# Q( m& B3 y( d) s2.1
+ s# t$ y( s" h# @1 Y5 v将PBMC按1-2 x 106/ml的浓度悬浮于无血清培养液中，加入1,000 U/ml 的重组人IFN-g，37oC，5%CO2培养箱中培养；
, _* O# y3 \' [" T8 G' D) l- T2.2# m" M0 T" {3 D7 \ z+ l
24h 后加入50ng/ml 的CD3 单克隆抗体和300 U/ml 的重组人IL-2，刺激CIK 细胞的生长和增殖；2 [ v' Q# H! ]5 f# E* D+ \% v
注：此时也可同时加入100 U/ml的重组人IL-1a。! ]' U: l- {/ j
2.3: n! I6 b7 U6 y2 |* K1 b; M
每3天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人IL-2 300 U/ml；
+ _. j7 k+ N; ?2 q2.43 V4 L0 y' X8 \5 G) ~' i
在培养的第14d，收获CIK细胞。
3 E/ F7 p4 _7 i8 I) D! f6 J J1 o2.5
' ~$ o3 q, N ZCIK细胞质控：
" ]* P q+ W+ J Q. P2.9.1
% [; `6 s. B' A/ b# `台盼蓝染色检测：活细胞应在80%以上；
& z H V* D. b. q8 n+ I2.9.2
' s7 U7 ^$ O/ N5 o# @, V$ P# c流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表达：CD3+CD56+细胞的比例应在20%以上。 g8 h+ R g& L
2.9.3
4 `- A, @' o4 z; V, ]$ t) s+ [1 K0 |细胞杀伤实验：以CIK细胞为效应细胞，以肿瘤细胞(可为原代肿瘤细胞或肿瘤细胞株)为靶细胞，将效应细胞与靶细胞按10 : 1(数目比) 的比例加入96 孔U 型板中，每孔含靶细胞1 x 104个，终体积为200 ml，设3个复孔。培养4h，然后取培养上清，用乳酸脱氢酶(LDH) 试剂盒检测效应细胞对靶细胞的杀伤率。
1 N8 ~6 H& V* J7 j- g1 ~9 S2.9.40 Z" c* \' v/ x
收获细胞前，取少量培养物进行细菌、真菌培养，并检测支原体、衣原体，及内毒素(标准：病原学检测阴性，内毒素<5 Eu)。! ?: n* U" R% F. ~
v* v" G6 [4 z) u- ^, ~
【步骤简图】
- p$ d& o' G3 H7 G" ~ " J! z6 b" Y' \0 Z$ n3 ]) G
1 r; B" u u, z. Y& o- }, C
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发表于 2015-3-3 19:37
发表于 2016-1-13 12:48
