【跪求流式大神】分选的流式图总是shift

w343989328

( g9 K, U9 c5 Q' [7 S4 z! i8 W/ d& B

# L& }8 Q3 y1 {/ C+ w% `3 n先说一下我实验的一些情况，我要从组织中分选一类细胞，两个表面抗原，一个正筛一个负筛。用的都是间标的抗体，杂一二抗。* o; J4 u0 h2 x3 e5 x
A抗体来源于大鼠，连着生物素的单抗，用Alexa Fluor 488标记的链霉素作为二抗；* J. I, e: r4 v. G4 R" l8 {4 v/ }
B抗体为兔多抗，我用donkey anti-rabbit Alexa Fluor 555作为二抗。
0 p5 }- @% Z; L9 V. K* m2 S学校的流式分选仪器是BD的AriaII，有358nm, 488nm, 633nm三种激发光，因此我这两个抗体只能选择488来激发。& j9 |( R7 P9 E
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实验的步骤大概是这样子：组织经胰酶+DNase消化，过滤得到单细胞悬液，镜检、计数。调整细胞浓度到1*10^7cells/ml，加入抗体。冰上同时孵育两个一抗一小时，洗两次，敷二抗半小时，洗两次，上流式前5min加入Hoechst33342，以便在区分掉死细胞。6 @8 m$ Y  W$ |  h( X4 Q
) {* Y1 Q9 r4 ]: {9 I4 h
以下是几次重复的结果：' l( ?/ S: V. n% E6 K8 ^* m5 J

2015-3-9 10:57 上传

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: i" Z. S' }& V0 R2 c7 i
首先是control组，不知道上头那坨东西是什么细胞（肯定不是死细胞，而且我抗体也不会加错），几次重复都或多或少有这么一群东西；
3 F( E" ?, _9 o+ M3 d2 B. m/ {6 X其次，FITC通道勉强能有一群细胞出来，但是整个population，包括nagetive cells，都往右偏；
* i4 n. u" ?0 j: P! V+ v. j' |而PE通道则整个群往上走，导致我没法分出细胞群。
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2015-3-9 10:57 上传

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/ \& U6 b: @: l: c; p这次结果好很多了，单独PE通道能分出群，但是一旦加入A抗体，则整个群依然往右shift。我这里要强调的是，基本上这个领域内所有的文献都报道这两个抗原属于两种细胞，而且我自己IF的结果也显示两种荧光并不merge，所以这里理论上不存在说细胞同时表达两种抗原的可能。- `8 `5 u4 t! K  a
但是呢，加入A抗体后，基本所有的细胞都会往右shift，所以将PE阳性的细胞带出我用control框出来的门P4。我个人觉得这里应该不能用补偿把细胞往左调吧？; s, u- N: R( ]9 o5 q3 X

2015-3-9 10:57 上传

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: y  a- `3 t- x. ~我重复了一次，和第二次的结果一样，细胞都是往右偏。
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一开始怀疑A抗体浓度过高或者孵育时间太久，但是减少浓度或者时间并没能改善结果。; A7 E: V( i  p( Z) \" \

/ q2 g% ~2 e# s/ ]9 b& c! K不知道有没有大神能帮忙解惑，不胜感激！

zz091115

还是没看仔细 来回翻页好麻烦 你可以用DAPI 358激光器 可以 Ho33342和几乎所有通道有点补偿 所以很不好 ( W, x0 {! N) a8 H

zz091115

你的流式根本没有能激发Ho33342的激光器 你用这东西搞笑了啊 DAPI你也不能用 你可以考虑用7AAD （PerCP5.5通道 488激光器激发）或是Draq7 （APC-CY7通道 633激光器激发）来区分死细胞 先去问问有没有那个通道 不要乱用东西

zz091115

另外提醒你Biotin的流式抗体只要4度15分钟就够了 你的非特异信号太多了 另外一个抗体你最好查查是不是可以做流式 如果可以 15分钟足矣

zz091115

刚才没仔细看你的实验 你是两步法 一定要用IgG做对照 另外 没人有Ho33342区分死细胞 Ho33342是做SP用的 活死细胞都能染上的 你需要用DAPI或是7AAD 调阈值对于信号不会有任何影响 只是机器把输出信号小于阈值的部分不显示不记录而已 问题在于原代细胞不是一个纯的细胞群体 所以斜角问题和粘连很严重 你可以用FSC-A FSC-H 来区分单细胞和粘连群体 你去看看文章 做上皮细胞的 比如肿瘤 都是斜向的 所以没关系 不用担心 做好对照就OK了

zz091115

刚才没仔细看你的实验 你是两步法 一定要用IgG做对照 另外 没人有Ho33342区分死细胞 Ho33342是做SP用的 活死细胞都能染上的 你需要用DAPI或是7AAD 调阈值对于信号不会有任何影响 只是机器把输出信号小于阈值的部分不显示不记录而已 问题在于原代细胞不是一个纯的细胞群体 所以斜角问题和粘连很严重 你可以用FSC-A FSC-H 来区分单细胞和粘连群体 你去看看文章 做上皮细胞的 比如肿瘤 都是斜向的 所以没关系 不用担心 做好对照就OK了

yuanyecat

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: P3 ?- `& |2 b: u& `你有没有做iso抗体看看非特异性结合,我觉得你这种情况是非特异性结合造成的，不用太在意和担心。

dollar007

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6 p+ g! w; d3 l6 ^, m2 r+ x/ a6 j4 D
举例说明：3 U1 c- ~+ C" ~) [0 W
调研下华人的身高、体重。调研员仅仅选取了欧美的华人取样分析，显然这样的调研数据会shift，欧美的华人是喝牛奶的，比我们这些吃米饭长大的身高、体重要大。
: b! o" f' V3 ~  o- g我是怀疑你阈值没设定对，你的目标细胞有大有小，你的仪器设定天然的将一部份小细胞屏蔽了，实验结果仅仅显示了大细胞的特征，所以shift。* o% f% p6 T* d% S$ a* v6 w/ h
个人推测。以前我也碰到过类似问题。空白本底其高无比，峰移出了阴性置信区间。

w343989328

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, o9 d8 ^) q$ Y" Z0 B8 h5 T
+ Y# i; ^$ k: b  ]4 }; Z谢谢你！可是我觉得这里的shift跟SSC FSC两个参数没太大关系啊。

zz091115

和机器 补偿什么的没有关系 是细胞本身的原因 你做的应该是上皮类细胞 如果是血液系统一般就不会