【跪求流式大神】分选的流式图总是shift

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* F! T  v# U$ N) w3 F% |先说一下我实验的一些情况，我要从组织中分选一类细胞，两个表面抗原，一个正筛一个负筛。用的都是间标的抗体，杂一二抗。
& H% q: ?$ ^6 F' _7 q  \* w, OA抗体来源于大鼠，连着生物素的单抗，用Alexa Fluor 488标记的链霉素作为二抗；# B+ x# W9 D/ s7 E; l
B抗体为兔多抗，我用donkey anti-rabbit Alexa Fluor 555作为二抗。- V  D7 ]! u+ {  O8 C. x/ P0 H
学校的流式分选仪器是BD的AriaII，有358nm, 488nm, 633nm三种激发光，因此我这两个抗体只能选择488来激发。
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实验的步骤大概是这样子：组织经胰酶+DNase消化，过滤得到单细胞悬液，镜检、计数。调整细胞浓度到1*10^7cells/ml，加入抗体。冰上同时孵育两个一抗一小时，洗两次，敷二抗半小时，洗两次，上流式前5min加入Hoechst33342，以便在区分掉死细胞。0 @: R1 E8 G/ i4 q) A8 J
4 Y; b2 @- C5 C7 n' o6 |, e3 m+ Y
以下是几次重复的结果：
  x2 R1 z: ?+ H

2015-3-9 10:57 上传

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" t! I" c+ }2 L8 t2 b首先是control组，不知道上头那坨东西是什么细胞（肯定不是死细胞，而且我抗体也不会加错），几次重复都或多或少有这么一群东西；
" F) W( s% B8 H% h: I# _8 j其次，FITC通道勉强能有一群细胞出来，但是整个population，包括nagetive cells，都往右偏；  y% k6 D( X1 C/ o. S7 P
而PE通道则整个群往上走，导致我没法分出细胞群。2 l: v) N( `) x2 J% w6 e, X

2015-3-9 10:57 上传

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* d+ S* |: K& s) ~7 l  g: i
这次结果好很多了，单独PE通道能分出群，但是一旦加入A抗体，则整个群依然往右shift。我这里要强调的是，基本上这个领域内所有的文献都报道这两个抗原属于两种细胞，而且我自己IF的结果也显示两种荧光并不merge，所以这里理论上不存在说细胞同时表达两种抗原的可能。5 E$ f3 r% P: w/ N& K
但是呢，加入A抗体后，基本所有的细胞都会往右shift，所以将PE阳性的细胞带出我用control框出来的门P4。我个人觉得这里应该不能用补偿把细胞往左调吧？
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2015-3-9 10:57 上传

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* @+ W+ G5 i, B5 _/ m# c
我重复了一次，和第二次的结果一样，细胞都是往右偏。6 y- E1 C) l  M( b( k0 l
0 s5 d) C. C, B/ V
一开始怀疑A抗体浓度过高或者孵育时间太久，但是减少浓度或者时间并没能改善结果。' A% o3 K3 c0 l4 c  w7 w5 H

- u4 x5 }; U0 x( {9 d, b2 f不知道有没有大神能帮忙解惑，不胜感激！

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回复 mantianfeiyun 的帖子
4 s: }/ Z4 U4 Y5 q5 ?4 h3 f- B8 |' W4 I
上面的图都是没有设置补偿的。
  W7 V. j; d4 I% y+ A& A8 W有一点我不是很明白，我这样只是单个通道的shift，这样调补偿没有意义吧？

w343989328

回复 dollar007 的帖子
9 R& g0 |5 k0 D+ X: j1 V
8 g4 `* B: N7 p  [' H: M谢谢您。您说的FS阈值是指什么呢？
( s4 q( T1 p- t: Q8 @8 U2 Q我用FSC SSC框下来的细胞是同一群，我不是很明白您说的肥胖细胞是指。。。

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顶一个

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求大神。。

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回复 dollar007 的帖子/ U% V; _  v8 P/ e

, e. O6 T% y6 v5 U9 C5 m. Z% X谢谢你！可是我觉得这里的shift跟SSC FSC两个参数没太大关系啊。