【跪求流式大神】分选的流式图总是shift

w343989328

# N0 E4 Y9 T4 E8 U5 H

6 U* M! b/ l2 |2 R6 t5 j1 L先说一下我实验的一些情况，我要从组织中分选一类细胞，两个表面抗原，一个正筛一个负筛。用的都是间标的抗体，杂一二抗。+ C$ h. k% o8 t; M7 k8 V
A抗体来源于大鼠，连着生物素的单抗，用Alexa Fluor 488标记的链霉素作为二抗；. Z# i7 k4 P! r1 C$ g  m
B抗体为兔多抗，我用donkey anti-rabbit Alexa Fluor 555作为二抗。2 O$ I4 P. a# u2 B; N* t  I$ _( L3 [
学校的流式分选仪器是BD的AriaII，有358nm, 488nm, 633nm三种激发光，因此我这两个抗体只能选择488来激发。
7 t) S. L- T0 T$ ^( r+ m) n) k0 \4 v/ V/ K! f: D5 F
实验的步骤大概是这样子：组织经胰酶+DNase消化，过滤得到单细胞悬液，镜检、计数。调整细胞浓度到1*10^7cells/ml，加入抗体。冰上同时孵育两个一抗一小时，洗两次，敷二抗半小时，洗两次，上流式前5min加入Hoechst33342，以便在区分掉死细胞。
% a# G: j, H/ a( ?  l8 i3 c2 R, B" w6 M1 Y3 ]) u  R  o, W
以下是几次重复的结果：
) v' y* y# E4 F) R# a: T

2015-3-9 10:57 上传

下载附件 (124.28 KB)

- b8 }5 e0 M* M- O3 A
首先是control组，不知道上头那坨东西是什么细胞（肯定不是死细胞，而且我抗体也不会加错），几次重复都或多或少有这么一群东西；
! o' G: n) \! k3 `, K其次，FITC通道勉强能有一群细胞出来，但是整个population，包括nagetive cells，都往右偏；
. `! l% C7 `1 S( A+ \9 W而PE通道则整个群往上走，导致我没法分出细胞群。
) B) N: l. L1 b2 j! Q7 H% T

2015-3-9 10:57 上传

下载附件 (117.5 KB)

4 S, l! ?  Z0 p这次结果好很多了，单独PE通道能分出群，但是一旦加入A抗体，则整个群依然往右shift。我这里要强调的是，基本上这个领域内所有的文献都报道这两个抗原属于两种细胞，而且我自己IF的结果也显示两种荧光并不merge，所以这里理论上不存在说细胞同时表达两种抗原的可能。+ S0 K8 X( N% B; ?( |5 G/ H
但是呢，加入A抗体后，基本所有的细胞都会往右shift，所以将PE阳性的细胞带出我用control框出来的门P4。我个人觉得这里应该不能用补偿把细胞往左调吧？
5 a& f+ x; k" L, J

2015-3-9 10:57 上传

下载附件 (120.59 KB)

, X1 y9 Y0 h  `/ [8 C, Q我重复了一次，和第二次的结果一样，细胞都是往右偏。" ?, n: k! ]$ Y5 O& ]$ l  ^% f. H

+ I4 t5 I! M. T1 Y3 Y( A一开始怀疑A抗体浓度过高或者孵育时间太久，但是减少浓度或者时间并没能改善结果。: \! w! y( Q2 a+ i
% E- v6 x4 D. ?7 \$ Y/ X4 `9 X
不知道有没有大神能帮忙解惑，不胜感激！

mantianfeiyun

1. 重做荧光补偿
. e# U9 g$ `& n
1 V+ K7 ~7 k; m( t3 O7 ]2. 洗涤流式细胞仪液路系统
( C' u  y4 K" _! G
4 S6 m6 L7 |" h0 Q个人建议，不一定对。

w343989328

回复 mantianfeiyun 的帖子) [2 k" u  O1 d( o% P4 v

- @# {" h: N" A* ?上面的图都是没有设置补偿的。
8 Q5 U7 A% d7 I  R/ ]% T有一点我不是很明白，我这样只是单个通道的shift，这样调补偿没有意义吧？

dollar007

单标，不需要补偿。
1 n4 B+ W" ?# i6 [% A0 Q; z3 c' i5 j4 lFLOWcheck、FLOWset都做过，没问题吧？
/ |9 k+ P3 e1 S0 e3 g, q你检查下你的数据采集时间，是否跟你的上样浓度符合——比如上样量为80-100万个细胞，体积300-500ul，那么数据采集速度大致在500-700个/秒，搜集1万个数据也就10来秒的时间。如果采集时间为30-40秒，那就是有很多数据都被仪器当噪音屏蔽了，说白点就是FS阈值设定高了，你当前分析的都是些肥胖细胞，所以图形shift。贝克曼的仪器一般默认是100，BD的不知道，你将它设定低点，再检测。

w343989328

回复 dollar007 的帖子
' s9 U( G! h* n0 s5 [8 k8 L) Y9 S7 }4 K1 ^% B: q
谢谢您。您说的FS阈值是指什么呢？
+ Q  _0 `/ {5 _/ I9 C+ K7 D我用FSC SSC框下来的细胞是同一群，我不是很明白您说的肥胖细胞是指。。。

w343989328

顶一个

w343989328

求大神。。

dollar007

流式通常用FS设阈值，贝克曼的通常这个值是100，即FS=100.仪器默认FS值小于100的信号为噪音信号，不纳入分析。初设定参数时，如果不清楚此细胞的特性，我们通常把阈值由低调到高，调到什么值合适呢——调到FS/SS散点图左下角能略看到一些碎片即可。如果阈值设定过高，那么碎片群你图上看不见，同样的有部分细胞信号也被屏蔽了。我以前做CIK双阳检测的时候发现的这个问题，上样量与检测速度不匹配，后来发现是这个问题，阈值采用机器默认的FS=100，在当时的电压下，80-90%的细胞都被漏检了（被仪器屏蔽了，认为是噪音。）当我把FS调整为50的时候，这部分数据才得以在图上显现出来。“肥胖”细胞是我做MSC时爱用的口语，通常MSC“干性”好时，细胞很幼稚、细小，表现为FS和SS值都很小，而一旦MSC成熟或者衰老时，细胞会变得很扁平、肥大，此时FS和SS值都很高。通常而言，肥大细胞即尺寸大，内容物更复杂、丰富，表现为FS/SS值更高，更易被检测出。
" `: h9 q, y8 w7 o希望对你的实验有帮助。

zz091115

和机器 补偿什么的没有关系 是细胞本身的原因 你做的应该是上皮类细胞 如果是血液系统一般就不会

w343989328

回复 dollar007 的帖子
7 F) v6 h) v" \# V1 J% g* W! k
3 V: v2 c2 m" G7 ?  y* ]% d9 p2 H谢谢你！可是我觉得这里的shift跟SSC FSC两个参数没太大关系啊。