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本帖最后由 w343989328 于 2015-3-9 11:12 编辑 2 z/ r" `+ _. n% E
6 Z, v* m/ F& C2 u" O0 \! z* C2 \先说一下我实验的一些情况,我要从组织中分选一类细胞,两个表面抗原,一个正筛一个负筛。用的都是间标的抗体,杂一二抗。9 x- c; N; @. L O$ |) T
A抗体来源于大鼠,连着生物素的单抗,用Alexa Fluor 488标记的链霉素作为二抗;" n9 T2 m+ x+ w ~
B抗体为兔多抗,我用donkey anti-rabbit Alexa Fluor 555作为二抗。& g7 c* r* N3 {7 H7 i
学校的流式分选仪器是BD的AriaII,有358nm, 488nm, 633nm三种激发光,因此我这两个抗体只能选择488来激发。
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实验的步骤大概是这样子:组织经胰酶+DNase消化,过滤得到单细胞悬液,镜检、计数。调整细胞浓度到1*10^7cells/ml,加入抗体。冰上同时孵育两个一抗一小时,洗两次,敷二抗半小时,洗两次,上流式前5min加入Hoechst33342,以便在区分掉死细胞。
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以下是几次重复的结果:
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首先是control组,不知道上头那坨东西是什么细胞(肯定不是死细胞,而且我抗体也不会加错),几次重复都或多或少有这么一群东西;3 [4 e2 p" ]! P2 D7 n
其次,FITC通道勉强能有一群细胞出来,但是整个population,包括nagetive cells,都往右偏;3 c$ d2 C6 h5 w& ]6 q/ X7 g. u& d
而PE通道则整个群往上走,导致我没法分出细胞群。
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这次结果好很多了,单独PE通道能分出群,但是一旦加入A抗体,则整个群依然往右shift。我这里要强调的是,基本上这个领域内所有的文献都报道这两个抗原属于两种细胞,而且我自己IF的结果也显示两种荧光并不merge,所以这里理论上不存在说细胞同时表达两种抗原的可能。1 ~+ F& h0 l1 h, o- R
但是呢,加入A抗体后,基本所有的细胞都会往右shift,所以将PE阳性的细胞带出我用control框出来的门P4。我个人觉得这里应该不能用补偿把细胞往左调吧?4 k" J( k6 V: ?' `
5 E5 n# q. [3 \* h我重复了一次,和第二次的结果一样,细胞都是往右偏。
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一开始怀疑A抗体浓度过高或者孵育时间太久,但是减少浓度或者时间并没能改善结果。5 _( ~8 X3 N, M$ V( l) ]6 ~
; B5 t% w" t2 n& ^! y) m不知道有没有大神能帮忙解惑,不胜感激! |
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