好文章：实验室中PCR引物设计所要关注的黄金法则 - 实验室综合讨论区干细胞之家



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发表于 2009-3-31 15:50 |只看该作者 |正序浏览 |打印

自从1985年KarnyMullis发明了聚合酶链式反应以来，PCR技术已成为分子生物学研! l) V4 C1 ^# s" X" H1 P1 u+ O0 i
究中使用最多、最广泛的手段之一[1]，而引物设计是PCR技术中至关重要的一环。使用不/ T% h, y' e( K& l/ W4 {4 T
合适的PCR引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚' N6 x5 u, u% q: m0 D2 `+ X
体带），不出带或出带很弱，等等。& J8 ?% S- R8 J, h! a
现在PCR引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得9 S" N& N- r0 |# u8 p: P- [, O: c
到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。一般来说，专门进行PCR
引物设计的专业软件功能更为强大，但使用起来却不太容易。本文将就引物设计原则及软件
使用问题进行探讨。2 d) w/ W- D; s% Y

1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 , C/ S( g9 ^+ o) J  Y# i
　　DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。
  p) I6 q; t" `
　　2.引物长度一般在15~30碱基之间。2 o& r4 F6 C- O( v' c

　　引物长度（primerlength）常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。

　　3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。
, V7 E! y# b& @* B. ]1 [) ]- q
　　GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

　　4.引物3′端要避开密码子的第3位。7 A9 ?0 C+ v) N! i4 x6 s

　　如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。

　　5.引物3′端不能选择A，最好选择T。
& L3 k& {6 _0 p* t2 D7 T4 H" ~
　　引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。
: i3 ~/ }1 |3 i2 w* R
　　6.碱基要随机分布。% w' n) G! k- h+ X% `+ p& V
( a5 [+ X8 l3 N: ]8 r
　　引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（Falsepriming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。

　　7.引物自身及引物之间不应存在互补序列。
& m7 t& r+ \; s; q2 M
　　引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。& S' k/ ]# G/ F2 N9 i' o# j; M# E

　　两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Crossdimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。

　　引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。
  V3 b/ i# T7 }+ R+ |
　　8.引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低。
! r* ]: r8 g, d
　　△G值是指DNA双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。应当选用5′端和中间△G值相对较高，而3′端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3′端的△G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。（不同位置的△G值可以用Oligo6软件进行分析）4 Z- m+ P) ]% z" P" E+ f

　　9.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。
( a( ^/ ]6 Y  E0 B. Z* w
　　引物的5′端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。
! W' u9 ^* S8 H5 g1 e8 {  Z( p
　　引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能。
* ^& Y9 }/ a2 O
　　10.扩增产物的单链不能形成二级结构。
% w8 s7 g# R2 a$ l* x! _# m
　　某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。; \) c# P, g" |' z# s) M

　　11.引物应具有特异性。2 I. y9 S, X  h
. @0 X  {, s5 x/ J; j, D, S4 P
　　引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。
9 n6 c# g: a0 [+ O& p; E
　　值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的PCR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。
: V5 q# x% K2 R$ P  W" X
　　做RealTime时,用于SYBRGreenI法时的一对引物与一般PCR的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求：
9 f5 _: n$ w9 e# I
　　1)避免重复碱基，尤其是G.
8 |! |& m2 Z' h' f7 v
　　2)Tm=58-60度。1 F  M! j( _7 [: c% s/ |5 D6 M

　　3）GC=30-80%.0 A5 K" _' a* O- @
, T* m- P: @/ t: o* j' M. t5 L3 b
　　4)3"端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C.

　　5)正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。

　　6)PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；80～150bp最为合适（可以延长至300bp）。3 I6 R+ g/ W* L, D9 V6 H5 }

　　7)引物的退火温度要高，一般要在60度以上；; w' N, V8 q* y; O/ |  ~( k2 ~" v

　　要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。
7 i0 H% u. k7 y$ o
　　而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。" `, N4 g4 }+ ~" S4 o

　　至于设计软件，PRIMER3,PRIMER5,PRIMEREXPRESS都应该可以的。
7 b$ C; S7 l/ E
　　做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。对于引物，你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备---寻找合适的引物非常不容易。
' C) L  u/ z/ v# N3 ~9 D7 J
　　关于BLAST的作用应该是通过比对，发现你所设计的这个引物，在已经发现并在GENEBANK中公开的不物种基因序列当中，除了和你的目标基因之外，还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列，如和你的目标序列之外的序列相同的序列，则可能扩出其他序列的产物，那么这个引物的特异性就很差，从而不能用。