谁做过囊胚注射生产嵌合体啊？讨论一下

zpzp0312

4 o6 P* N$ P, |! k1 H4 V8 }" C9 [9 r# U# v9 c( W( `: O/ H
最近想尝试一下，之前没做过。' u+ Z8 l# f5 f; |: D5 M7 ]3 m
ES细胞消化后，形成的单细胞不是很多，感觉很多都是连在一起的。所以用注射针吸细胞时很困难。而且经常会在针尖处形成黏连的大团，堵塞注射针。
, M% g7 O4 C2 |1 c2 W  I并且注射针在使用过程中，在针尖内壁经常附着石蜡油，影响控制。: c) _. B  ^2 G) ?; ~$ m
, P* ~5 h9 S7 m5 P# d
哪位做过，诚心求教！~~~

taote

不是很懂，纯支持，帮你顶一下

swzyh

针一定的用PVP或BSA溶液处理之后再操作，干细胞培养的不好，可能消化时间短

zpzp0312

3# swzyh
- B4 W; h2 w& @; I4 \
- q; r7 g/ v9 U# a" i同意！( t$ |3 k& C7 }$ N1 R
确实细胞预处理不到位
" X% {9 N9 {: ]! G2 \要是说的详细些就更好了

yyn2004

细胞要充分消化成单细胞 而且室内温度要降低否则细胞容易贴壁

niyou

" ~3 b" w7 |4 y' E" v
) }6 J+ t  L" F2 f& J1 I* S关于囊胚注射生产嵌合体
3 }  c, b1 a5 C7 t    我看了楼主的显微操作图片，有以下几个问题：# n$ s2 L7 [0 ?; R8 `% F6 ?
1、干细胞的问题' X; \% l/ s$ u% }5 e& X9 o, i
   我们做过很多次，我建议你用预温PBS洗细胞一次，再用预温Gibco 0.05%胰酶消化3－5分钟，用培养基终止消化，枪头吹打10次，即可得到单细胞悬液，离心200g，5分钟，弃上清，用适量ES培养基重悬细胞沉淀，在适宜大小（3.5或6cm）组织培养皿中在培养箱内差速贴壁20分钟（去除饲养层细胞和分化的ES细胞），以得到较为纯化的ES单细胞，吸取细胞悬液与EP管中，置冰上。降低温度防止ES粘集。如此制备的ES悬液可在3－4小时内使用。* K3 Y, C+ u* c! `4 v& O
2、注射针的问题
4 d8 u' t0 Z+ Z; d9 G8 Y   显微注射针（Injection micropipette）应该用聚乙烯吡咯烷酮（PVP）洗内壁，减少ES细胞在内壁粘集。
2 A3 }" [  F9 P, w4 y# _7 N3、囊胚的问题& h* J0 v* s) [6 D# g2 k+ x8 s
   看你用的囊胚还是未充分扩张囊胚（早期囊胚），应该用充分扩张囊胚，最经典的书籍【小鼠胚胎操作实验指南】有介绍

zpzp0312

6# niyou 3 p; c6 c) R: {) y
! K$ t4 L* |; O7 E8 z4 t% b

& {4 T% t, D2 e% G# ~& v0 m目前我们已经把很多问题都解决了
9 c8 c. s2 K. }5 |' F7 f, z但还是存在石蜡油在注射针内壁附着的问题  I9 }* v1 ?- [9 P0 U; d
我们使用的是10%的PVP

niyou

两点提示：1 k; c* u1 \) g+ t
    1、石蜡油是不是购买的sigma (货号8410)，或其它大公司的产品，排除油质的问题。+ I- ~2 p4 X" z3 [1 ]
    2、制备显微注射针用的玻璃毛细管是国产的还是进口的，如果是国产的建议采用三步处理法：稀盐酸充分浸泡过夜或大于24小时；蒸馏水冲洗20遍，millipore超纯水洗涤三次；180度烘烤两小时。这样可以彻底去除生产玻璃管时内壁附着的有机物等杂质，减少石蜡油附壁。如果经费充足，建议购买美国WPI公司的玻璃毛细管以制备显微注射针。
; L2 J9 A1 t% M    3、PVP都是采用10％的.

zpzp0312

8# niyou
, ^* t: X) C1 g* _: H9 S" X+ q' N3 A# P

1 q$ C7 A5 [5 w( E5 m1 W" t  K感谢！~~~
0 J; `& A  ]6 L我们用的是国产玻璃管，其他用品都是大公司的产品。
' L* D7 T; e: W! Q如果用WPI玻璃管，是不是不经任何处理就可以进行拉制？
$ s  u" |* n. R9 [另外WPI玻璃管的规格是多少？0 Z6 O4 j  ^/ X, Q# `
在拉制过程中，感觉内径0.8mm的要比0.6mm的拉制的针效果好（壁薄）。
) s4 B  w# g) {/ o9 j我们主拉力80，副拉力30
! N9 W) R$ r, q3 ^" r
' T5 f- @; R( {. r5 o9 |% {麻烦，给个WPI公司订货的方式吧？！
" a. @1 ^% v- |" d以前没和WPI打过交道8 x+ J& N) T2 Q1 [# e% b$ `
谢谢！

niyou

WPI玻璃毛细管不用处理就可以进行拉制，9 r- l: D. w; ^! C
WPI玻璃毛细管规格：长度10cm,直径：外径1mm，内径0.75 mm5 H4 C8 j- T2 ^- N' ?4 g" d
你说的对，薄壁比厚壁玻璃毛细管好拉好用
- }2 ^; P) v9 y; i! L: J8 h3 K  m你的拉力参数也许可以，不同的玻璃毛细管需要的参数不一样，需要测试并调整
' n% ?2 p' \4 h3 J1 q' y' OWorld Precision Instruments - WPI Inc.你上Google去搜，国内应该有代理。