个人关于NK细胞培养的经验分享及见解

chenlin080102

首先介绍一下本人自己的研究成果吧，目前能利用外周血来源PBMCs培养17天，扩增120倍，纯度（CD3-CD56+)达到70%左右。
) f  g# M/ Y% e大致培养过程：
/ `& U0 b9 E& D9 zD0
8 L2 V& x9 |0 p" K4 y, Y4 h/ H用肝素钠抗凝的采血管采集外周血，按照常规方法分离及获取自体血清灭火冷冻备用；将细胞密度调整未200万/ml。$ G; i/ q! q. z5 p, d
培养瓶可以选择用单抗提前包被过夜，也可以用溶解性单抗，再加入相应的刺激因子（包括激活剂）培养。/ _8 _" w, n- K6 f$ r8 S5 v; O! n
D3
) C; X2 n$ l, u: z对细胞进行离心换液，并将细胞转移至新的培养瓶中，此时培养液中不许添加激活剂，只需要扩增因子，将密度重新调整为200万/ml
( H9 p( l/ C6 h9 Y9 w& ?D6-D17
& U8 L* w9 \. R8 r每隔两天计数并调整密度为200万/ml4 b* s; h! {1 f) s5 ^6 x! }& d
D17( Z' b$ ]" p1 l& `+ n, Z/ n
收集细胞并表型检测。4 f9 Q& J: f/ Z, d/ W/ }
此技术取50毫升外周血培养17天能达到60亿细胞，纯度达70%左右。: {. a+ F* {/ M) t2 J1 H

( T3 b) D# @( D9 K2 N% @/ ^另外再分享一下开发NK工艺的经验/ g, i8 S# C. `1 O
1、查看很多文献里面都是利用IL-2和IL-15或者再添加另外的白介素类因子去培养，本人验证了非常多次都无法实现，要么数量上不去，要么纯度上不去。# [  y7 y" L/ e, R
2、另外很多文献选择利用磁珠分选的方法培养，这个方法的缺陷在于分选成本高，而且纯NK扩增慢，而且分选后所得起始细胞数太少，所以最后虽然纯度达到了，但是数量还是很难满足临床需求，要是用于科研的话另当别论了。, C( E' ^; T( T! H+ R2 L* T* a
3、还有一个能在纯度和数量上都满足的培养工艺就是利用基因改造的K562细胞（在K562表面加入两个跨膜蛋白）做滋养细胞，培养半个月能扩增200倍的样子，但是好像这个工艺在临床上存在一定的伦理问题，毕竟滋养细胞本身就是癌变细胞，虽然在理论上是能用射线完全灭活K562，但是实际情况就不得而知了（此工艺我也做过）。, ?* H  k1 i: o7 v- b# \
! n* ?# S) \4 o- n; k( q) d4 ^. p
以上纯属个人在做NK培养工艺过程的一些想法。0 i- m( \: z8 G( A- h" W8 l
另外对NK培养提几点经验：) k5 o, |: `: n  w, O1 p
1、个人觉得临床上还是用纯因子刺激的方法比较好，另外为什么只用纯粹的白介素类因子不能大量扩增，因为这些都不是很强烈的激活刺激剂，缺乏强有力的激活调动剂。这些白介素类因子在细胞活化后维持活性及扩增是没问题的，所以建议还在做优化的朋友可以考虑添加合适的刺激佐剂，具体的就不便透露了。# s# Z1 c- O. W/ n, B( K
2、培养基的选择也比较重要，同时也不是越贵越好
  g- C3 U6 t. \# ?3、个人的经验来看NK的培养密度还是挺重要的，特别是接种密度，当接种密度低于200万/ml时扩增时间明显滞后，可能与个人工艺相关吧。
2 h! ^. f6 P/ x7 D4、不同品牌的因子也比较重要，因为不同品牌的效价是不一样的，建议多尝试。

cg001

不错，这个对于NK细胞的培养是有指导意义

暖羊羊

回复 chenlin080102 的帖子7 A/ f3 r+ r3 U; y) K, D) c8 h
7 ?5 T. u" z0 }
楼主的意思是  不加扩增剂（基因改造的K562），只加刺激、扩增因子即可在17d达到扩增120倍的结果？这很好呀，可以弱弱的问扩增因子除了白介素类得还有什么吗？如果不方便说具体的，可以说功能，我们自己摸索，最近实验室也想尝试不用滋养细胞培养的方法。

chenlin080102

回复 暖羊羊 的帖子
1 i4 l+ S5 r1 Y) A) U$ o3 d
" W3 s7 H9 v9 J! ^7 F  u3 T可以选择添加一些临床用药作为刺激佐剂，跟免疫功能相关的药物

syj7888

NK细胞用白介素21刺激不是更好吗？不过需要太多，所以成本增加很多，太贵，所以才会用K562方法

lunyuyuanxj

曾经做过一组实验，纯度能达到50%以上，数量也不少，具体记不清了，但重复试验时效果不理想

yanglixia1984

什么是激活剂 什么是扩增剂？D3天只加了扩增剂，什么时候添加激活剂呢

chenlin080102

回复 syj7888 的帖子
' e9 B5 a; `% Y4 E7 W
% L& Y: o( Z; p4 J# C- p" M  p0 b: ^$ o尝试过IL21对NK培养的效果并不是很理想，单纯依靠这些白介素是很难在数量和纯度上都达到理想效果的，如果使用IL21的话生产成本就会很高。

chenlin080102

回复 lunyuyuanxj 的帖子5 S# _8 N4 l' P. g2 j1 f, ]
+ e* E/ t1 G3 t6 u; T- ^+ G) i
这应该是个体差异的个例吧

shellyanlanlan

学习了