个人关于NK细胞培养的经验分享及见解

chenlin080102

首先介绍一下本人自己的研究成果吧，目前能利用外周血来源PBMCs培养17天，扩增120倍，纯度（CD3-CD56+)达到70%左右。2 c+ z7 }8 l/ C; K) E8 e: V
大致培养过程：9 O9 {) M% e4 Z; b3 s9 ?3 s
D0& e0 ]" A* {6 ~
用肝素钠抗凝的采血管采集外周血，按照常规方法分离及获取自体血清灭火冷冻备用；将细胞密度调整未200万/ml。  _% a) B# E4 a' R  X
培养瓶可以选择用单抗提前包被过夜，也可以用溶解性单抗，再加入相应的刺激因子（包括激活剂）培养。
: e8 F: |9 |& e: a9 d0 Y& \8 yD3' `" _( S. n: V3 G0 a& E0 M
对细胞进行离心换液，并将细胞转移至新的培养瓶中，此时培养液中不许添加激活剂，只需要扩增因子，将密度重新调整为200万/ml
( S: k0 z  e, G# F) RD6-D17
2 C% s( M2 P% a# x7 \' ?每隔两天计数并调整密度为200万/ml
. {9 Y. _0 P) X3 V0 C* ED17' e, B- n7 g' {0 V; A5 Q
收集细胞并表型检测。
4 k: h0 Z, L. m5 c+ F此技术取50毫升外周血培养17天能达到60亿细胞，纯度达70%左右。$ S$ g( _- l4 }7 w5 L

) j( s0 b7 F- P另外再分享一下开发NK工艺的经验
7 ~* n- z5 u8 Z  j1、查看很多文献里面都是利用IL-2和IL-15或者再添加另外的白介素类因子去培养，本人验证了非常多次都无法实现，要么数量上不去，要么纯度上不去。9 C6 a( U2 {: x3 Y2 r: P( n% {  Y
2、另外很多文献选择利用磁珠分选的方法培养，这个方法的缺陷在于分选成本高，而且纯NK扩增慢，而且分选后所得起始细胞数太少，所以最后虽然纯度达到了，但是数量还是很难满足临床需求，要是用于科研的话另当别论了。% w% I1 o: [( g; x
3、还有一个能在纯度和数量上都满足的培养工艺就是利用基因改造的K562细胞（在K562表面加入两个跨膜蛋白）做滋养细胞，培养半个月能扩增200倍的样子，但是好像这个工艺在临床上存在一定的伦理问题，毕竟滋养细胞本身就是癌变细胞，虽然在理论上是能用射线完全灭活K562，但是实际情况就不得而知了（此工艺我也做过）。9 w6 A9 W1 }) z6 |7 C  f& {; S

) i: w8 s% E* Y5 ]% T. y1 q以上纯属个人在做NK培养工艺过程的一些想法。
( Q' X5 M: h: q另外对NK培养提几点经验：
' z6 k; D( V2 ]2 K1、个人觉得临床上还是用纯因子刺激的方法比较好，另外为什么只用纯粹的白介素类因子不能大量扩增，因为这些都不是很强烈的激活刺激剂，缺乏强有力的激活调动剂。这些白介素类因子在细胞活化后维持活性及扩增是没问题的，所以建议还在做优化的朋友可以考虑添加合适的刺激佐剂，具体的就不便透露了。) l( W# j- ?6 P5 i+ h
2、培养基的选择也比较重要，同时也不是越贵越好) n* y  W+ @' x7 C
3、个人的经验来看NK的培养密度还是挺重要的，特别是接种密度，当接种密度低于200万/ml时扩增时间明显滞后，可能与个人工艺相关吧。
! a+ F) i% T, q$ E8 h( U4、不同品牌的因子也比较重要，因为不同品牌的效价是不一样的，建议多尝试。

jinhaifeng

学习了

木木木木

太感谢，受教了

好雨知春

鑫鑫向荣

有没有人加入CD16的

昭昭

学习了

tyzbtx

常规分离液分离外周血的淋巴细胞，主要是T、NK细胞，要想获得高纯度NK，要找到一种降低T细胞增殖效率且能使NK大量扩增的试剂，这种筛选试剂，可以多查查资料，会有收获。

veda327

楼主，在纯度和扩增效率上，是IL-21的效果更好还是您使用的激活剂更好呢？

saliai2016

培养撤掉激活剂以后继续培养三天，细胞数量马上下降回起始量了，是不是要培养更长时间？

只因偶然

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3 t4 L8 x! J- X, B7 N为什么NK细胞培养第3天要离心换液，是为了去除NK细胞激活剂吗