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首先介绍一下本人自己的研究成果吧，目前能利用外周血来源PBMCs培养17天，扩增120倍，纯度（CD3-CD56+)达到70%左右。
9 Y$ s- H5 A& a4 c3 Q# r+ q大致培养过程：
3 j% _! \ _1 |2 v g; w5 S5 gD0+ W5 s/ L& C* s/ W+ a! w
用肝素钠抗凝的采血管采集外周血，按照常规方法分离及获取自体血清灭火冷冻备用；将细胞密度调整未200万/ml。
% j; `) t1 K# w/ O, \" e3 n0 j& l$ B培养瓶可以选择用单抗提前包被过夜，也可以用溶解性单抗，再加入相应的刺激因子（包括激活剂）培养。
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对细胞进行离心换液，并将细胞转移至新的培养瓶中，此时培养液中不许添加激活剂，只需要扩增因子，将密度重新调整为200万/ml# X7 W) {: j0 \
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4 |$ f0 @, ] u- S) N% N每隔两天计数并调整密度为200万/ml0 J) Z. O6 x- }" w( y0 y; ~
D17
& k( O: k3 k& R( }7 O) P/ W收集细胞并表型检测。
% u W) ~ Z: N0 {: _, i/ j/ n此技术取50毫升外周血培养17天能达到60亿细胞，纯度达70%左右。
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另外再分享一下开发NK工艺的经验
/ u2 b2 T& j; h3 Q L! `9 G1、查看很多文献里面都是利用IL-2和IL-15或者再添加另外的白介素类因子去培养，本人验证了非常多次都无法实现，要么数量上不去，要么纯度上不去。. e7 K! m, {4 p
2、另外很多文献选择利用磁珠分选的方法培养，这个方法的缺陷在于分选成本高，而且纯NK扩增慢，而且分选后所得起始细胞数太少，所以最后虽然纯度达到了，但是数量还是很难满足临床需求，要是用于科研的话另当别论了。! d$ R4 h& k a: O6 P2 _: E
3、还有一个能在纯度和数量上都满足的培养工艺就是利用基因改造的K562细胞（在K562表面加入两个跨膜蛋白）做滋养细胞，培养半个月能扩增200倍的样子，但是好像这个工艺在临床上存在一定的伦理问题，毕竟滋养细胞本身就是癌变细胞，虽然在理论上是能用射线完全灭活K562，但是实际情况就不得而知了（此工艺我也做过）。# b: E4 l( U2 M6 C
% [8 a" H1 M1 U: `! B1 L( n以上纯属个人在做NK培养工艺过程的一些想法。
+ R k/ |9 o) O( D* Y另外对NK培养提几点经验：
" x" S3 q, \3 k8 p. E, K1、个人觉得临床上还是用纯因子刺激的方法比较好，另外为什么只用纯粹的白介素类因子不能大量扩增，因为这些都不是很强烈的激活刺激剂，缺乏强有力的激活调动剂。这些白介素类因子在细胞活化后维持活性及扩增是没问题的，所以建议还在做优化的朋友可以考虑添加合适的刺激佐剂，具体的就不便透露了。
$ W5 Z4 Z2 l q* w. s* h2、培养基的选择也比较重要，同时也不是越贵越好
4 c! `& L! R( A3、个人的经验来看NK的培养密度还是挺重要的，特别是接种密度，当接种密度低于200万/ml时扩增时间明显滞后，可能与个人工艺相关吧。7 q9 G- [9 i) Z! A( {5 N6 N
4、不同品牌的因子也比较重要，因为不同品牌的效价是不一样的，建议多尝试。 |
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发表于 2015-4-29 22:16
