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首先介绍一下本人自己的研究成果吧，目前能利用外周血来源PBMCs培养17天，扩增120倍，纯度（CD3-CD56+)达到70%左右。 F" o, `3 G0 A1 _; _$ b
大致培养过程：4 _- ~2 n0 \) [8 a
D04 d# N0 U& f* T3 N# r
用肝素钠抗凝的采血管采集外周血，按照常规方法分离及获取自体血清灭火冷冻备用；将细胞密度调整未200万/ml。
9 f k8 v; @0 }" D( g培养瓶可以选择用单抗提前包被过夜，也可以用溶解性单抗，再加入相应的刺激因子（包括激活剂）培养。
) r+ W. z9 A4 t( E6 H" VD3- R$ _6 _* G: }: x$ c
对细胞进行离心换液，并将细胞转移至新的培养瓶中，此时培养液中不许添加激活剂，只需要扩增因子，将密度重新调整为200万/ml5 P9 C; {5 K: Q+ O' v
D6-D17! \2 Z9 V1 j5 d+ c, g- K* b
每隔两天计数并调整密度为200万/ml$ ?# u/ e! \7 K
D17
~8 V7 g+ I' e& D/ |6 `: \0 ]* A收集细胞并表型检测。# R6 v* }, P9 V
此技术取50毫升外周血培养17天能达到60亿细胞，纯度达70%左右。
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; W. b: @, K7 P0 H6 M& U另外再分享一下开发NK工艺的经验/ Z+ g0 _/ Q, ?2 h, l
1、查看很多文献里面都是利用IL-2和IL-15或者再添加另外的白介素类因子去培养，本人验证了非常多次都无法实现，要么数量上不去，要么纯度上不去。
3 Q$ ?) r" Q' n" b9 H+ N' ]) Z* q2、另外很多文献选择利用磁珠分选的方法培养，这个方法的缺陷在于分选成本高，而且纯NK扩增慢，而且分选后所得起始细胞数太少，所以最后虽然纯度达到了，但是数量还是很难满足临床需求，要是用于科研的话另当别论了。
1 N; T, g# P7 P: W1 Z- l2 D% o3、还有一个能在纯度和数量上都满足的培养工艺就是利用基因改造的K562细胞（在K562表面加入两个跨膜蛋白）做滋养细胞，培养半个月能扩增200倍的样子，但是好像这个工艺在临床上存在一定的伦理问题，毕竟滋养细胞本身就是癌变细胞，虽然在理论上是能用射线完全灭活K562，但是实际情况就不得而知了（此工艺我也做过）。9 p' `: p8 J9 I$ i: m
0 ?! G6 t& `, l" U" J* x/ Q0 D B以上纯属个人在做NK培养工艺过程的一些想法。
; {7 D0 d, q) N+ K! [8 d另外对NK培养提几点经验：0 d( g* V5 B/ D9 R" @- ]* Y
1、个人觉得临床上还是用纯因子刺激的方法比较好，另外为什么只用纯粹的白介素类因子不能大量扩增，因为这些都不是很强烈的激活刺激剂，缺乏强有力的激活调动剂。这些白介素类因子在细胞活化后维持活性及扩增是没问题的，所以建议还在做优化的朋友可以考虑添加合适的刺激佐剂，具体的就不便透露了。% j) F7 l3 Q) I4 s7 x, Z' X. o
2、培养基的选择也比较重要，同时也不是越贵越好
^/ ^3 w; U" L) f u. A( s3、个人的经验来看NK的培养密度还是挺重要的，特别是接种密度，当接种密度低于200万/ml时扩增时间明显滞后，可能与个人工艺相关吧。1 x8 ^" L3 F& x( M5 Z4 V
4、不同品牌的因子也比较重要，因为不同品牌的效价是不一样的，建议多尝试。 |
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发表于 2015-4-29 22:16
