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首先介绍一下本人自己的研究成果吧，目前能利用外周血来源PBMCs培养17天，扩增120倍，纯度（CD3-CD56+)达到70%左右。
) j. \! L& z. K8 A# z大致培养过程：" R% \' J* \& B1 E* H
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- E) k# h% W& W用肝素钠抗凝的采血管采集外周血，按照常规方法分离及获取自体血清灭火冷冻备用；将细胞密度调整未200万/ml。& C7 q! Q; d' C$ V5 u
培养瓶可以选择用单抗提前包被过夜，也可以用溶解性单抗，再加入相应的刺激因子（包括激活剂）培养。0 a) Z- ]$ @. \" x
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对细胞进行离心换液，并将细胞转移至新的培养瓶中，此时培养液中不许添加激活剂，只需要扩增因子，将密度重新调整为200万/ml
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每隔两天计数并调整密度为200万/ml2 |% K0 q( R$ n+ P+ N$ U4 Y! C
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1 ?. Z6 Q+ Z3 {$ e @7 ^ p. `9 n( `收集细胞并表型检测。
' D. W. z/ Y8 X$ i; Q此技术取50毫升外周血培养17天能达到60亿细胞，纯度达70%左右。% N7 V& o6 c0 g5 N! S7 n. Y
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另外再分享一下开发NK工艺的经验
; x i6 y) G4 L6 V' J1、查看很多文献里面都是利用IL-2和IL-15或者再添加另外的白介素类因子去培养，本人验证了非常多次都无法实现，要么数量上不去，要么纯度上不去。" z6 L- E: L; b
2、另外很多文献选择利用磁珠分选的方法培养，这个方法的缺陷在于分选成本高，而且纯NK扩增慢，而且分选后所得起始细胞数太少，所以最后虽然纯度达到了，但是数量还是很难满足临床需求，要是用于科研的话另当别论了。& r: r& s- q0 L1 J
3、还有一个能在纯度和数量上都满足的培养工艺就是利用基因改造的K562细胞（在K562表面加入两个跨膜蛋白）做滋养细胞，培养半个月能扩增200倍的样子，但是好像这个工艺在临床上存在一定的伦理问题，毕竟滋养细胞本身就是癌变细胞，虽然在理论上是能用射线完全灭活K562，但是实际情况就不得而知了（此工艺我也做过）。
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4 K* U0 l3 x3 P" f% h" N以上纯属个人在做NK培养工艺过程的一些想法。
* E$ p9 B* C4 \7 y6 [/ x另外对NK培养提几点经验： D0 v# b1 Y1 }3 q
1、个人觉得临床上还是用纯因子刺激的方法比较好，另外为什么只用纯粹的白介素类因子不能大量扩增，因为这些都不是很强烈的激活刺激剂，缺乏强有力的激活调动剂。这些白介素类因子在细胞活化后维持活性及扩增是没问题的，所以建议还在做优化的朋友可以考虑添加合适的刺激佐剂，具体的就不便透露了。
I; w6 n' t' J1 t+ r: P$ K2、培养基的选择也比较重要，同时也不是越贵越好8 p2 p0 `+ g2 ] x( Q$ r* K1 E
3、个人的经验来看NK的培养密度还是挺重要的，特别是接种密度，当接种密度低于200万/ml时扩增时间明显滞后，可能与个人工艺相关吧。
- p3 [1 c; B! ~, @( p4、不同品牌的因子也比较重要，因为不同品牌的效价是不一样的，建议多尝试。 |
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发表于 2015-4-29 22:16
