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首先介绍一下本人自己的研究成果吧，目前能利用外周血来源PBMCs培养17天，扩增120倍，纯度（CD3-CD56+)达到70%左右。( r& G& \( g. S! W9 B
大致培养过程：
9 {' `" z' V$ J) [- N- @1 sD0
0 |0 ~8 Y0 Q2 P) e" y用肝素钠抗凝的采血管采集外周血，按照常规方法分离及获取自体血清灭火冷冻备用；将细胞密度调整未200万/ml。
Z" M* H& J8 ^& D' `) N培养瓶可以选择用单抗提前包被过夜，也可以用溶解性单抗，再加入相应的刺激因子（包括激活剂）培养。0 n8 l2 ]/ ]. I, g
D3
9 {% L' J* c6 L; c: k# @6 M; ]4 o2 c- t对细胞进行离心换液，并将细胞转移至新的培养瓶中，此时培养液中不许添加激活剂，只需要扩增因子，将密度重新调整为200万/ml
, W, g7 x/ R" p/ w( L& o6 h. CD6-D17% _$ j6 e2 G3 p8 Q; c9 Q4 k6 r6 R
每隔两天计数并调整密度为200万/ml
5 [. R+ a9 i& X; `6 S9 mD17
, X7 X/ H7 H5 ?. c' _4 x* A收集细胞并表型检测。6 P+ F2 Z, ^: J
此技术取50毫升外周血培养17天能达到60亿细胞，纯度达70%左右。
" i) X, e8 U1 ~- S- @+ K1 S! X: J: u/ |: U$ {
另外再分享一下开发NK工艺的经验
6 p7 [+ w8 d; \/ a* C8 M# G9 V1、查看很多文献里面都是利用IL-2和IL-15或者再添加另外的白介素类因子去培养，本人验证了非常多次都无法实现，要么数量上不去，要么纯度上不去。$ ^+ w- Z: l1 U$ P
2、另外很多文献选择利用磁珠分选的方法培养，这个方法的缺陷在于分选成本高，而且纯NK扩增慢，而且分选后所得起始细胞数太少，所以最后虽然纯度达到了，但是数量还是很难满足临床需求，要是用于科研的话另当别论了。( G0 f' j. v9 w) H2 q
3、还有一个能在纯度和数量上都满足的培养工艺就是利用基因改造的K562细胞（在K562表面加入两个跨膜蛋白）做滋养细胞，培养半个月能扩增200倍的样子，但是好像这个工艺在临床上存在一定的伦理问题，毕竟滋养细胞本身就是癌变细胞，虽然在理论上是能用射线完全灭活K562，但是实际情况就不得而知了（此工艺我也做过）。
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以上纯属个人在做NK培养工艺过程的一些想法。: G E/ V+ o2 e3 {2 N7 M, p5 A- A
另外对NK培养提几点经验：# y: |; m' }3 m
1、个人觉得临床上还是用纯因子刺激的方法比较好，另外为什么只用纯粹的白介素类因子不能大量扩增，因为这些都不是很强烈的激活刺激剂，缺乏强有力的激活调动剂。这些白介素类因子在细胞活化后维持活性及扩增是没问题的，所以建议还在做优化的朋友可以考虑添加合适的刺激佐剂，具体的就不便透露了。
3 e1 Z2 g$ \ m. D0 g' M' P& [2、培养基的选择也比较重要，同时也不是越贵越好
+ @) k5 C: Z) c3、个人的经验来看NK的培养密度还是挺重要的，特别是接种密度，当接种密度低于200万/ml时扩增时间明显滞后，可能与个人工艺相关吧。6 s1 I" _& f4 a0 H" q! j
4、不同品牌的因子也比较重要，因为不同品牌的效价是不一样的，建议多尝试。 |
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发表于 2015-4-29 22:16
