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首先介绍一下本人自己的研究成果吧，目前能利用外周血来源PBMCs培养17天，扩增120倍，纯度（CD3-CD56+)达到70%左右。
( H: P. Y+ N, }8 B大致培养过程：
9 o) _1 b! Z6 h8 p6 OD00 s1 N% F Z3 D2 L
用肝素钠抗凝的采血管采集外周血，按照常规方法分离及获取自体血清灭火冷冻备用；将细胞密度调整未200万/ml。+ `% P9 w' n$ Z, ~4 [
培养瓶可以选择用单抗提前包被过夜，也可以用溶解性单抗，再加入相应的刺激因子（包括激活剂）培养。
# T _9 R& I) Y3 _6 {+ R5 v0 H7 \D3
- ^3 r/ P4 V9 _& O+ m6 ^. g% V3 u3 A. L对细胞进行离心换液，并将细胞转移至新的培养瓶中，此时培养液中不许添加激活剂，只需要扩增因子，将密度重新调整为200万/ml
. @* j) c- L3 ~6 s9 v4 qD6-D17
3 _$ |# Z9 h A. D# T1 k8 A r每隔两天计数并调整密度为200万/ml {" d- Y' T. s
D17+ E- s' P3 u% p1 x+ @( A) d
收集细胞并表型检测。! ^2 i: {- t7 b' ]$ k9 M. E# D$ e$ M
此技术取50毫升外周血培养17天能达到60亿细胞，纯度达70%左右。
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; l, P2 ]8 b% b, _( ?另外再分享一下开发NK工艺的经验
6 M1 D8 b3 ~) f! B1、查看很多文献里面都是利用IL-2和IL-15或者再添加另外的白介素类因子去培养，本人验证了非常多次都无法实现，要么数量上不去，要么纯度上不去。$ p' k, o5 v2 U" n( @; l2 m
2、另外很多文献选择利用磁珠分选的方法培养，这个方法的缺陷在于分选成本高，而且纯NK扩增慢，而且分选后所得起始细胞数太少，所以最后虽然纯度达到了，但是数量还是很难满足临床需求，要是用于科研的话另当别论了。
$ }- k1 ]* ^" ~" X+ F0 r9 }- h3、还有一个能在纯度和数量上都满足的培养工艺就是利用基因改造的K562细胞（在K562表面加入两个跨膜蛋白）做滋养细胞，培养半个月能扩增200倍的样子，但是好像这个工艺在临床上存在一定的伦理问题，毕竟滋养细胞本身就是癌变细胞，虽然在理论上是能用射线完全灭活K562，但是实际情况就不得而知了（此工艺我也做过）。
6 _ b0 G1 S- M w. N. ?; J F1 y+ L# K/ p8 ?. Y- V; w7 D% [$ ~
以上纯属个人在做NK培养工艺过程的一些想法。% p& |: F& {5 h4 E
另外对NK培养提几点经验：
* G5 w ` j) E$ I; A, U% \/ E1、个人觉得临床上还是用纯因子刺激的方法比较好，另外为什么只用纯粹的白介素类因子不能大量扩增，因为这些都不是很强烈的激活刺激剂，缺乏强有力的激活调动剂。这些白介素类因子在细胞活化后维持活性及扩增是没问题的，所以建议还在做优化的朋友可以考虑添加合适的刺激佐剂，具体的就不便透露了。* Y: L- r7 i7 S- D% e
2、培养基的选择也比较重要，同时也不是越贵越好
$ m. Z$ H" q, r7 r; c) n6 W3、个人的经验来看NK的培养密度还是挺重要的，特别是接种密度，当接种密度低于200万/ml时扩增时间明显滞后，可能与个人工艺相关吧。2 J) K, [# U' O" D: K! [. T
4、不同品牌的因子也比较重要，因为不同品牌的效价是不一样的，建议多尝试。 |
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发表于 2015-4-29 22:16
