个人关于NK细胞培养的经验分享及见解

chenlin080102

首先介绍一下本人自己的研究成果吧，目前能利用外周血来源PBMCs培养17天，扩增120倍，纯度（CD3-CD56+)达到70%左右。
: L( r' t5 A. g( s+ q" p8 U大致培养过程：
5 f, R9 \# H% ]9 L6 q- C- M# nD0
9 [% E+ k3 p/ s1 N5 I) |, P用肝素钠抗凝的采血管采集外周血，按照常规方法分离及获取自体血清灭火冷冻备用；将细胞密度调整未200万/ml。
: V/ k; ]8 T, B0 ~9 n7 L7 H3 s培养瓶可以选择用单抗提前包被过夜，也可以用溶解性单抗，再加入相应的刺激因子（包括激活剂）培养。
! Y2 l: X1 e' {" b$ m9 c( g4 l" y" {D3; F6 f' R' M) ]3 ^4 W
对细胞进行离心换液，并将细胞转移至新的培养瓶中，此时培养液中不许添加激活剂，只需要扩增因子，将密度重新调整为200万/ml
0 a; L$ n/ Q& t1 U: ~9 I3 @D6-D17) J1 @- Z3 n1 p8 z" E. s# V( X
每隔两天计数并调整密度为200万/ml
- I* N7 h5 m+ x2 z9 a3 P+ Z; HD17# z7 k& s9 H) g( U. [$ s0 N: }
收集细胞并表型检测。
+ W8 }# e  o; g* g$ V4 x) d此技术取50毫升外周血培养17天能达到60亿细胞，纯度达70%左右。
1 @9 O8 r2 s; s# j3 h1 ]
+ \* Y( A* f, ]2 X  h另外再分享一下开发NK工艺的经验" S) D  H7 {& s" _
1、查看很多文献里面都是利用IL-2和IL-15或者再添加另外的白介素类因子去培养，本人验证了非常多次都无法实现，要么数量上不去，要么纯度上不去。
0 {/ A4 M8 S9 E" Y  X8 n$ I2、另外很多文献选择利用磁珠分选的方法培养，这个方法的缺陷在于分选成本高，而且纯NK扩增慢，而且分选后所得起始细胞数太少，所以最后虽然纯度达到了，但是数量还是很难满足临床需求，要是用于科研的话另当别论了。
" o/ r, t6 E/ D) M' ]; e8 A9 Y3、还有一个能在纯度和数量上都满足的培养工艺就是利用基因改造的K562细胞（在K562表面加入两个跨膜蛋白）做滋养细胞，培养半个月能扩增200倍的样子，但是好像这个工艺在临床上存在一定的伦理问题，毕竟滋养细胞本身就是癌变细胞，虽然在理论上是能用射线完全灭活K562，但是实际情况就不得而知了（此工艺我也做过）。
' J5 R) r3 ?" p+ U5 {$ A. v4 A! Z1 i- l  F0 v: \& P9 q  J" ?0 l
以上纯属个人在做NK培养工艺过程的一些想法。! P6 ]" g$ z6 f- f
另外对NK培养提几点经验：
# h+ s/ V; J, r' B* ]1、个人觉得临床上还是用纯因子刺激的方法比较好，另外为什么只用纯粹的白介素类因子不能大量扩增，因为这些都不是很强烈的激活刺激剂，缺乏强有力的激活调动剂。这些白介素类因子在细胞活化后维持活性及扩增是没问题的，所以建议还在做优化的朋友可以考虑添加合适的刺激佐剂，具体的就不便透露了。
2 ^# f$ d3 D4 }1 ]2、培养基的选择也比较重要，同时也不是越贵越好' U+ J6 W0 x1 I
3、个人的经验来看NK的培养密度还是挺重要的，特别是接种密度，当接种密度低于200万/ml时扩增时间明显滞后，可能与个人工艺相关吧。
' k& `1 M2 b& d) V, U4、不同品牌的因子也比较重要，因为不同品牌的效价是不一样的，建议多尝试。

cg001

不错，这个对于NK细胞的培养是有指导意义

暖羊羊

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" Z: v7 R5 w+ J; p
( Q- q, p% a7 D% ^楼主的意思是  不加扩增剂（基因改造的K562），只加刺激、扩增因子即可在17d达到扩增120倍的结果？这很好呀，可以弱弱的问扩增因子除了白介素类得还有什么吗？如果不方便说具体的，可以说功能，我们自己摸索，最近实验室也想尝试不用滋养细胞培养的方法。

chenlin080102

回复 暖羊羊 的帖子9 U, U" J) X2 ?! v6 d7 N4 F4 [: a

( B! S* H2 w- Y3 I# h2 l可以选择添加一些临床用药作为刺激佐剂，跟免疫功能相关的药物

syj7888

NK细胞用白介素21刺激不是更好吗？不过需要太多，所以成本增加很多，太贵，所以才会用K562方法

lunyuyuanxj

曾经做过一组实验，纯度能达到50%以上，数量也不少，具体记不清了，但重复试验时效果不理想

yanglixia1984

什么是激活剂 什么是扩增剂？D3天只加了扩增剂，什么时候添加激活剂呢

chenlin080102

回复 syj7888 的帖子8 _9 K* Q, H( k1 K* D% O4 _
* l" S1 J" c3 ^- h% {
尝试过IL21对NK培养的效果并不是很理想，单纯依靠这些白介素是很难在数量和纯度上都达到理想效果的，如果使用IL21的话生产成本就会很高。

chenlin080102

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# h5 G8 [3 l5 T' J4 `! R/ i. D, T# S5 j% j. A
这应该是个体差异的个例吧

shellyanlanlan

学习了