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首先介绍一下本人自己的研究成果吧，目前能利用外周血来源PBMCs培养17天，扩增120倍，纯度（CD3-CD56+)达到70%左右。
2 g9 w0 a' j) T+ s; S# d4 J, q/ f' h大致培养过程：1 X d6 ?$ z( N3 C8 N
D0
C8 \" Q, o8 w4 E# h6 l0 o用肝素钠抗凝的采血管采集外周血，按照常规方法分离及获取自体血清灭火冷冻备用；将细胞密度调整未200万/ml。
/ `# e1 d; E4 h6 F! [培养瓶可以选择用单抗提前包被过夜，也可以用溶解性单抗，再加入相应的刺激因子（包括激活剂）培养。) P3 M3 Z0 l& A2 z$ s* e! q
D34 G0 F3 _; H$ ^/ C
对细胞进行离心换液，并将细胞转移至新的培养瓶中，此时培养液中不许添加激活剂，只需要扩增因子，将密度重新调整为200万/ml
) U0 Q6 u9 R$ D6 _% X! F$ i1 RD6-D17
9 `2 V: H+ |! A8 C' T/ x每隔两天计数并调整密度为200万/ml+ ~' P1 c, |) Q$ I
D17& H5 o7 Q: N) n. G9 K9 g2 ~
收集细胞并表型检测。7 m$ m: d0 J% F5 z1 q
此技术取50毫升外周血培养17天能达到60亿细胞，纯度达70%左右。
& I. M( z+ |; t) J1 C& z4 v, E. Z2 @' T
另外再分享一下开发NK工艺的经验
) I9 j% N+ l* w1、查看很多文献里面都是利用IL-2和IL-15或者再添加另外的白介素类因子去培养，本人验证了非常多次都无法实现，要么数量上不去，要么纯度上不去。! E, Y+ ~% G- P0 h3 w4 x& P* N
2、另外很多文献选择利用磁珠分选的方法培养，这个方法的缺陷在于分选成本高，而且纯NK扩增慢，而且分选后所得起始细胞数太少，所以最后虽然纯度达到了，但是数量还是很难满足临床需求，要是用于科研的话另当别论了。
* o) l6 [- o1 k3 z3、还有一个能在纯度和数量上都满足的培养工艺就是利用基因改造的K562细胞（在K562表面加入两个跨膜蛋白）做滋养细胞，培养半个月能扩增200倍的样子，但是好像这个工艺在临床上存在一定的伦理问题，毕竟滋养细胞本身就是癌变细胞，虽然在理论上是能用射线完全灭活K562，但是实际情况就不得而知了（此工艺我也做过）。$ o; w% f. I- d; ]' ]
' Q/ R1 n. u+ |5 t以上纯属个人在做NK培养工艺过程的一些想法。 k9 U2 ~1 ~; x/ C0 Q1 [
另外对NK培养提几点经验：
$ ~3 n) k0 D. b1、个人觉得临床上还是用纯因子刺激的方法比较好，另外为什么只用纯粹的白介素类因子不能大量扩增，因为这些都不是很强烈的激活刺激剂，缺乏强有力的激活调动剂。这些白介素类因子在细胞活化后维持活性及扩增是没问题的，所以建议还在做优化的朋友可以考虑添加合适的刺激佐剂，具体的就不便透露了。) q( Y5 r* L. ]8 G4 U7 G
2、培养基的选择也比较重要，同时也不是越贵越好
1 u0 o+ W1 a8 \. n8 l3、个人的经验来看NK的培养密度还是挺重要的，特别是接种密度，当接种密度低于200万/ml时扩增时间明显滞后，可能与个人工艺相关吧。# I/ V% P! A# s7 P8 A
4、不同品牌的因子也比较重要，因为不同品牌的效价是不一样的，建议多尝试。 |
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发表于 2015-4-29 22:16
