|
- 积分
- 224
- 威望
- 224
- 包包
- 797
|
 
首先介绍一下本人自己的研究成果吧，目前能利用外周血来源PBMCs培养17天，扩增120倍，纯度（CD3-CD56+)达到70%左右。' j. o" b, @: e6 T
大致培养过程：
' p# `+ p \$ eD0
9 Z& f; W+ Z! M! ^用肝素钠抗凝的采血管采集外周血，按照常规方法分离及获取自体血清灭火冷冻备用；将细胞密度调整未200万/ml。& B. y" s4 }7 z3 z6 U. W# _7 s5 W
培养瓶可以选择用单抗提前包被过夜，也可以用溶解性单抗，再加入相应的刺激因子（包括激活剂）培养。+ x* W; T1 `( C
D3
. o9 Q/ y0 u4 _3 Q0 f对细胞进行离心换液，并将细胞转移至新的培养瓶中，此时培养液中不许添加激活剂，只需要扩增因子，将密度重新调整为200万/ml! \3 h$ y9 P3 U9 H8 S, k( T
D6-D17
# ?) ^/ ^4 }; M1 Q" `0 c每隔两天计数并调整密度为200万/ml+ l- J& \6 k4 @0 ^, u: N
D17
0 V! O( T* P0 N- ]& c收集细胞并表型检测。
7 K5 h2 R! k2 b. w此技术取50毫升外周血培养17天能达到60亿细胞，纯度达70%左右。
" H, }. A: s4 j, B$ L8 y" R
, t6 ~% ?# H: A, I$ A- |( [另外再分享一下开发NK工艺的经验* e7 ^& l, r/ t$ C+ c, Y
1、查看很多文献里面都是利用IL-2和IL-15或者再添加另外的白介素类因子去培养，本人验证了非常多次都无法实现，要么数量上不去，要么纯度上不去。. G( A! L6 U" {8 X, h% [
2、另外很多文献选择利用磁珠分选的方法培养，这个方法的缺陷在于分选成本高，而且纯NK扩增慢，而且分选后所得起始细胞数太少，所以最后虽然纯度达到了，但是数量还是很难满足临床需求，要是用于科研的话另当别论了。" \. ]- h$ v/ _' w$ @8 q
3、还有一个能在纯度和数量上都满足的培养工艺就是利用基因改造的K562细胞（在K562表面加入两个跨膜蛋白）做滋养细胞，培养半个月能扩增200倍的样子，但是好像这个工艺在临床上存在一定的伦理问题，毕竟滋养细胞本身就是癌变细胞，虽然在理论上是能用射线完全灭活K562，但是实际情况就不得而知了（此工艺我也做过）。
2 S- X, t$ V# B% J0 E5 Q% l# ]7 d9 r/ N/ F
以上纯属个人在做NK培养工艺过程的一些想法。
, J/ g' k* F0 u; n) {另外对NK培养提几点经验：
$ d/ `: G9 v: ?* F' O. i1、个人觉得临床上还是用纯因子刺激的方法比较好，另外为什么只用纯粹的白介素类因子不能大量扩增，因为这些都不是很强烈的激活刺激剂，缺乏强有力的激活调动剂。这些白介素类因子在细胞活化后维持活性及扩增是没问题的，所以建议还在做优化的朋友可以考虑添加合适的刺激佐剂，具体的就不便透露了。' _3 G+ g+ x: b% S
2、培养基的选择也比较重要，同时也不是越贵越好
+ }! v) I- V8 z/ a: p$ Q4 l3、个人的经验来看NK的培养密度还是挺重要的，特别是接种密度，当接种密度低于200万/ml时扩增时间明显滞后，可能与个人工艺相关吧。8 u. O5 [, l# j8 [" l) y2 ]
4、不同品牌的因子也比较重要，因为不同品牌的效价是不一样的，建议多尝试。 |
-
总评分: 威望 + 34
包包 + 60
查看全部评分
|
发表于 2015-4-29 22:16
