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首先介绍一下本人自己的研究成果吧，目前能利用外周血来源PBMCs培养17天，扩增120倍，纯度（CD3-CD56+)达到70%左右。
: M/ _1 U6 A9 m5 A7 S1 U# [3 Y大致培养过程：
, W: G6 E2 c8 c8 `0 f& {9 K' b$ qD0
1 ~' t: q/ t4 X$ U$ o用肝素钠抗凝的采血管采集外周血，按照常规方法分离及获取自体血清灭火冷冻备用；将细胞密度调整未200万/ml。7 k& f% k6 |0 } b* {9 L0 r
培养瓶可以选择用单抗提前包被过夜，也可以用溶解性单抗，再加入相应的刺激因子（包括激活剂）培养。
d: _* y9 ^! LD3
; Q* Z1 V% y$ B" A对细胞进行离心换液，并将细胞转移至新的培养瓶中，此时培养液中不许添加激活剂，只需要扩增因子，将密度重新调整为200万/ml4 r/ C$ i' p5 D( Z0 A
D6-D17
* T6 b7 g0 [) ^5 R8 Z每隔两天计数并调整密度为200万/ml" n4 }' ?5 [" i2 W4 F
D17* n3 W1 @8 }' P* Q1 Z
收集细胞并表型检测。
P6 H& ? y- _$ J此技术取50毫升外周血培养17天能达到60亿细胞，纯度达70%左右。
: }$ g y! F( A2 u0 T7 y' ?" ]# i. B3 {) `8 M3 \; n( ?2 R. n
另外再分享一下开发NK工艺的经验* Y! R9 k8 |5 ]5 h+ b* F9 r; G' S
1、查看很多文献里面都是利用IL-2和IL-15或者再添加另外的白介素类因子去培养，本人验证了非常多次都无法实现，要么数量上不去，要么纯度上不去。5 U0 i) J1 k) v6 H: t
2、另外很多文献选择利用磁珠分选的方法培养，这个方法的缺陷在于分选成本高，而且纯NK扩增慢，而且分选后所得起始细胞数太少，所以最后虽然纯度达到了，但是数量还是很难满足临床需求，要是用于科研的话另当别论了。 Y) D( f9 n/ s, ~
3、还有一个能在纯度和数量上都满足的培养工艺就是利用基因改造的K562细胞（在K562表面加入两个跨膜蛋白）做滋养细胞，培养半个月能扩增200倍的样子，但是好像这个工艺在临床上存在一定的伦理问题，毕竟滋养细胞本身就是癌变细胞，虽然在理论上是能用射线完全灭活K562，但是实际情况就不得而知了（此工艺我也做过）。; ~+ \- v5 h8 {0 G
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以上纯属个人在做NK培养工艺过程的一些想法。
! z* K8 d4 k; I, C: e J# ^5 Z- I另外对NK培养提几点经验：
; J! q; W s! ^' |1、个人觉得临床上还是用纯因子刺激的方法比较好，另外为什么只用纯粹的白介素类因子不能大量扩增，因为这些都不是很强烈的激活刺激剂，缺乏强有力的激活调动剂。这些白介素类因子在细胞活化后维持活性及扩增是没问题的，所以建议还在做优化的朋友可以考虑添加合适的刺激佐剂，具体的就不便透露了。9 e% @5 Y& M9 Z( I
2、培养基的选择也比较重要，同时也不是越贵越好( L1 K0 W0 p x8 o+ o' h5 T
3、个人的经验来看NK的培养密度还是挺重要的，特别是接种密度，当接种密度低于200万/ml时扩增时间明显滞后，可能与个人工艺相关吧。% Q) K3 ]4 k6 J4 h
4、不同品牌的因子也比较重要，因为不同品牌的效价是不一样的，建议多尝试。 |
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发表于 2015-4-29 22:16
