求助：关于质粒转染

yinchong42

请问质粒转染时，其表达的基因最多能在细胞中维持几天？如果是体内质粒转染，最多能在动物体内维持多久呢？
4 s* F2 p0 R6 X+ X! _: b非常感谢！

yinchong42

回复 weiyepan 的帖子( _' I4 ]  E6 o( o
- n$ L% n# n- _  W' R6 ~- R
你好，不好意思没有及时回复，我注射的是颅骨皮下，现在问题已经解决了，少量注射和mock组是不会导致脾肿大的

weiyepan

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# K8 {" G# I. \1 r; J" K4 b  V$ ]( b$ B) l  f& W2 }  E) b
你注射到什么位置啊？

yinchong42

回复 weiyepan 的帖子& i5 a4 q0 d3 g+ U3 q% d

, N+ x# m5 E$ b$ w  K5 b" ^目前只有注射带有表达蛋白的质粒会引起脾肿大，mock组未发现问题

weiyepan

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' G; }- a& K) q. D4 A, Z8 I3 I
# [( Y: c8 w( i4 l. c: U( o质粒注射你确定不会引起免疫？

yinchong42

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+ W6 K5 u$ G* C2 U! [" L' O. `7 Z. f- ^( c& |8 t/ x, l0 f
非常感谢您的帮助，其实稳定转染的话肯定还是病毒更靠谱，但我们也在考虑用质粒转染看看能否用G418筛选然后用做体外实验，体内实验的话我们的蛋白需要很长时间才能发挥作用，所以我们设计了五次注射，每次间隔15天，目前已经进行了两次，但我看别人的文章上最多也就是给两次作用，不知道质粒注射次数过多会不会有什么不好

weiyepan

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# j0 e! I/ H3 {3 A" g- D( V- ^& E- H. v) ]
质粒整合传代不稳定的，尤其是需要整合率比较低的情况下，传代容易丢。整合率低的普遍比整合率高的的长的速度快，传代次数越多，整合率低的占比会越来越重，蛋白表达量就会越来越低。转染能转进去的细胞种类最多只有30%左右，病毒能远远高于这个比例。另外电转也是有极限的，质粒大一点就进不去，容易把质粒电降解。

weiyepan

回复 yinchong42 的帖子& C9 V8 @+ X' Q/ V: h

& a: j: Y. @' k" F4 {1. 一般环状DNA在细胞内能维持3天以上，线性化的DNA有整合的概率，但是能维持的时间比较短。整合的不在瞬转的讨论范围之内。( ]; N3 z* v  O( t7 t/ |
2. 考虑细胞分裂对DNA的稀释。细胞分裂的越快，稀释度越大，背景蛋白就越多。5 _9 T+ ?, n0 {, R8 z7 T* U( ]$ D
3. 所以蛋白的表达曲线以单个细胞（相同背景）计算，其实是一个抛物线。一开始DNA多，mRNA也稳定，表达水平相对较高。随着DNA的稀释，表达速度开始下降。降到什么时候到底，主要是看蛋白的降解速度，蛋白稳定的，可以维持15天以上（例如荧光蛋白），蛋白不稳定的，也差不多有5天（例如萤光酶素）。蛋白不会降解的，一般会对细胞造成影响，造成细胞死亡。

yinchong42

回复 cyz3057 的帖子: x; b! {; h* ^% F0 L

' L/ o' ?$ [$ b  ]/ n可能也是因为以前没有可靠的体内质粒转染方法才依赖病毒的吧，现在体内电转开始越来越多了，

yinchong42

回复 芦苇浅 的帖子; e! {6 h! S/ v4 C4 z. u, J2 e" m

* A! k4 s. i; N7 N0 ]1 ~以前我也是不相信瞬时转染能维持那么久，但是上个月听报告有人用体内电转，维持了28天还能做出wb条带，我自己的实验也发现给药一次就有很显著的变化，所以才问的。。