原代培养脂肪来源的间充质干细胞-day3

Cyclone2009

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第一次做脂肪干的原代培养，贴了两张图（图一，二），都是提取后第三天的。大家看看像脂肪干么？当然后面我要做三向分化和流式的。
# D9 Y% n( Z3 K- j首先LZ犯了一个错误，一只SD大鼠提取的脂肪组织大约3-4ml，是不是最后接种在T25的flask培养比较好？ 我没有注意到种在了T75的flask，导致密度特别稀，是不是不太好养活了呀？4 U. z3 `: I% O& t
另外想请教两个问题：0 F- R! b+ Z+ K4 e
1. 我是用0.1%I型胶原酶，量为脂肪体积的两倍，这个量合适么？嫌多么？
$ u( F4 Y3 z# V3 _7 i7 {$ ]/ q2. 我是在37℃的空气摇床上摇1h消化，摇床的转速是220转/min，是不是太大了，把细胞都摇碎了？调整成100r/min不知道可不可以？
; O+ j! h, B7 H) M图一：
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图二：
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9 w, Z. N+ z9 @1 O5 J
图三：我在flask还看到这些个东西，感觉类似于铺路石，是晶体还是内皮细胞也贴壁了呀？# R. [3 Z% Y& i2 ?! f9 f" G3 D

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图四：这个是实验室一个staff做的脂肪干，现在是P3，怎么细胞形态像蜘蛛一样的多角形，梭形的很少，是细胞不好了么？请专业人士指导呀？, f* I0 O+ |! O2 k  o3 x" }
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/ H2 b6 x2 B. }; I谢谢！！

saier.HK

1.那个浓度的胶原酶可以；
5 {; b$ W* L! N2 h2.最好37℃水浴摇床，这样效果更好；
$ ~( j# {3 C* F, v" a/ P3.明显细胞太稀，刚开始最好种的密度大些；
. `' @3 ]5 F  @$ u3 j! _% T, p$ C# ^% ]3 h4.细胞太杂，并且细胞好像缺营养，15%FBS DMEM较好（个人经验）；9 a  D/ c! b. ~: f+ c! r& I" c
5.这个细胞量肯定不够你后续的实验用。祝你好运！

hefan1234

1.胶原酶浓度还可以；
+ o; x$ P' r$ r* Z4 j" v7 g% J8 [, e5 l2.我们实验室也是37℃摇床，不过转速是150r/min，30min（主要看你的胶原酶效果好不好，效果好的话半个小时差不多了）；1 v' ]0 Z$ Q. y4 }4 O6 w
3.细胞的确中的太稀了，建议开始种T25的培养瓶；
2 @, g1 n1 m8 K1 O6 I5 J" ^4.同楼上，也是用的含15%胎牛血清的培养基；

Cyclone2009

回复 hefan1234 的帖子* H) B. d4 x1 i& U- O- s* @0 s# \

8 B9 }/ R- i( c% A) g# V5 L6 l, E感谢呀。。* q0 t1 L' B2 l0 a' s0 g
想问下你们是如何判断脂肪消化的差不多了的呢？# x4 I3 m* e$ K- m  g6 ^! w6 f: ?
乳糜状？

hefan1234

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5 @+ b' w3 c2 J$ q; |! o) }; l4 R0 D0 d1 l& g9 @# p8 v2 m
是的，差不多乳糜状，主要是脂肪小团块都被消化掉就差不多了，消化太久脂肪干细胞活性变差。我们培养的是人脂肪干细胞，脂肪块消化前经过清洗剪碎，发现消化过头的脂肪干细胞活性不好且容易提前老化。你做的小鼠脂肪干细胞，看图片主要原因应该是种的太稀了，没贴壁的细胞有但不是很多，所以不能判断是否消化时间过长或转速高导致细胞活性低。

Cyclone2009

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/ c6 I* b9 Y& b8 }7 f- p3 ]) J
  g5 D$ x7 Z4 _恩，十分感谢指点。) k) q4 z: P. `1 ~) G* O
我觉得可能是种在T75 flask的原因么。提取的脂肪就3-4mL，种那么大的flask应该会导致细胞密度太稀了吧。。
' Q9 n8 c% T' T# N下次准备用T25 flask接种。。2 f4 ~, e; \# w7 \
再次感谢啦！！