请教各位专家老师培养CIK为什么出现这种问题

hyg5481655

我们的培养体系大概如下：E-vivo，不加血清，D0加入IFN 1000u/ml，D1加入CD3单抗50ng/ml，IL-2 300u/ml，按颜色变化补液，CD3单抗加到了D6天，IL-2一直加。前几天状态还不错，D6天的流式图发现有死亡的趋势，附了几张图片，各位有经验专家老师有没有遇到这种情况？" m4 O0 R8 s- Q, b
D0健康人外周血：$ k/ N4 x5 I$ x% C- z+ m$ s2 q+ D8 a, m

0 [9 G) W5 u; W  ]! rD4：
3 ^6 L7 X* \( W! U6 u4 m4 L
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' k- @4 B- w& o9 J. r% _: zD6的时候拍了几张照片：' F( G! s! Z: M% w1 }4 \

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可以看到D6的时候状态就不太好了，流式图中也能看到CIK的比例在下降* e" U- q" P& K+ V# x( E! }6 G
请教各位老师几个问题：
3 n+ c0 O/ X) \" N1. CD3单抗只加一次还是一直加？文献提到只加一次，也有说一直加的
6 s( h$ H) H5 g+ Z1 W" V2. IL-2的量是否过低？
" f* B: O3 ]9 Y3 y$ n3. 镜下看到单个的细胞活性还好，有折光性，为何聚集成团的细胞看不出折光性？6 B1 b6 g8 g8 [0 F# k" P' I
4. 培养基的温度影响有多大？预热到室温还是37度？  F* G9 Y, |0 i* [

5 F" ?3 c3 M! U3 W' [( U$ @

chenguangyu

1-cd3单抗加一次就够了，无需一直加。
: B7 Y: `+ R$ @/ M* c& @! E2-白介素一直加是什么意思？不用一直加，第二天之后只需在扩增或补液时补加即可。
: J+ l& A4 g4 A" O( a# f& p. H) p3-从图中看，你细胞状态不好，杂质多，建议提更纯的单个核细胞，注意接种密度和体积。

hyg5481655

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0 V/ N. ~5 \& D+ S# T0 f( w. P" F5 p0 O% z
谢谢。

小梓莜

回复 hyg5481655 的帖子, H1 F2 H; m" R* ^3 O5 R5 C- S

6 C2 }! y! @, F2 ?4 ]0 q自体血清灭活后，可以高速离心下，去除浑浊。转速和时间文献上不大一致，我们选用的是3000rpm,10min。希望对你有帮助

wilian2002

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hyg5481655

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, g4 [2 S5 K9 e( m( H0 c. k% `; ^" ]3 _
嗯，已经分了加自体血清组了，我们提的自体血清有些浑浊，不知道是否有影响，热灭活的

小梓莜

回复 hyg5481655 的帖子7 `4 m( j6 n. i5 ?4 Z1 v, u

7 O8 i5 r  m3 u, \( b& u, b+ W培养基和细胞因子都挺重要的，祝好运！

yaxiao5708

加自体血清吧~加了会长的好，以前我们不加血清就不大养的起来

hyg5481655

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+ G; a: \- f& r6 E, O( W7 A. y9 P
9 R" j: w! ?0 l# n- g因为细胞一直没养好，养不到D14就死了，所以细胞数目、双阳率、活率什么的都谈不上。这周换了几种因子，貌似结果还不错，有了好的结果我再把结果贴上来。

小梓莜

回复 hyg5481655 的帖子4 w# |0 z; R1 e7 V5 a& T$ M
5 Y. T& n& }2 l- A& |$ O
我纯粹是做实验，养到过D21天，双阳性为40%左右，细胞数量3*109，活率90%。那我想问下，您那边养到14天，细胞数目、双阳率、活率均为多少呢？