探讨DC-CIK的培养

hyg5481655

前几天在论坛上发了两篇CIK培养不好的帖子，广大坛友提出了不少建议和意见，非常感谢。今天的结果出来了（x-vivo无血清，OKT3 50ng/ml，IL-300IU/ml，D8天混合）贴出来供大家评价，本人也有几点疑问想和大家探讨。
9 e' j0 @! S; f  B- K4 g) J之前D14的结果：  ]7 y' N+ D$ c7 u4 s

& M4 \  K, H8 i& R: X- |# i; R/ }这次D14天结果：' N" y( u3 B, X2 X( c
0 T7 g+ T, v- {2 i
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两图是用了旧的OKT3（怀疑有问题）和新OKT3的结果，差别不大，所以不是OKT3的问题。3 \' ~: _/ s5 \. n& {8 w0 H( B) ?
IL-2换了一批新的，所以怀疑是以前的IL-2有问题。
$ V. N% E8 ?0 O现有几个问题请教坛友：
7 ]- b5 D& b9 f! d1. 今天的流式结果可以看到我调高了FSC阈值，使碎片所占比例减少，相当于提高淋巴细胞群占所有events的比例，40%多，这个数据是否满足回输要求？
( r7 ~/ o* b- r- q3 [" M2. 细胞的数目不多。80ml的外周血提PBMC的时候计数为2*10的8次方，最后收获的时候竟然只有1.8*10的8次方，也就是说14D里几乎没有增殖，明显还是有问题？IL-2的量是否太少？$ Q( s! T' c8 r' Z5 U
3. 我们是用培养瓶培养，由于经常补液，我看到操作人员用175T的瓶子里面的培养基都超过100多ml了，是否是因为液体过多影响了气体交换导致的不增殖了？培养瓶和培养袋的差别大吗？
9 b1 a7 [/ \! x. H4. 无血清培养体系和加少量血清（2%、5%）会不会导致细胞数目质的区别？这种情况加2%的血清就会让细胞数目的增长有几十倍？

lzlmiranda

1，这个问题很难回答，从双阳性比例上来说30%不低了，但是另外的那部分细胞占比还是有些大。3 I- I! E1 u; k  g) o
2，80ml的外周血分离出2*10^8的PBMC这个没问题，但是14天里面CIK一点都不长有两种可能性，病人自己的血液有问题，细胞活力不够；或者你的培养方法有问题，经典的培养方法第一天加IFN-γ，24小时后加CD3（OKT3）、IL-2,、IL-1α，之后根据细胞生长速度，补含有IL-2的培养液。IL-2的浓度不是一个确定值，我了解的从300——2000的都有，根据你自己所使用的IL-2的品质来摸索。, f0 a( Q& l4 d( i* {% E
3，培养袋的好处一个是方便操作，一个是省空间，如果不考虑操作的问题，培养袋和培养瓶单位培养基产出的细胞数目上有差别，但不会有质的差别。据我了解，175的培养瓶加液到150-200ml 的情况都有，所以你细胞数量差距如此之大，不可能是因为培养瓶的问题。
3 q4 P* A6 t. O( M8 m4 i; k4，我曾经试验过用在无血清培养基里添加5%的胎牛血清做对比，效果并没有显著差异。另外重申，我做的只是实验，并没有进入人体。动物血清不应该进入细胞培养体系中。

lyj-0017

回复 hyg5481655 的帖子3 }9 d& ^. b' ], m! y; _
2 g+ d4 U8 i( J* G& h- q! P) S" n1 `
1、提高阈值对双阳细胞比例不会有太大影响，双阳比例能做到20%左右是行业的共识。
  q. q, o7 p# j' F2 g2、IL-2浓度可以适当提高一些，500-1000U/ml较为合适，但你培养14天，细胞数量竟然比初始量还少，这点说不过去，你的双阳表型还挺好，不会是计数计算错了吧，数量级对了吗？" f1 p% W: U# P4 b; ~' @0 z% n: W
3、细胞培养过程中是可以看出培养液颜色变化的，100ml的总体积不少了。
& Y  Q. b/ F0 }# m. k4、加与不加血清肯定会对细胞数量有影响，但不会影响特别大。

yuanyecat

回复 hyg5481655 的帖子' M" J! g' r: f" @! u
+ W8 J& Y# `9 B7 U' O% z, t8 U8 v
1. 这个数据没有问题，一般CD3+CD56+所占比例超过30%，但是你还要看看CD4+CD25+的Treg比例是多少一般不要超过5%，细胞总体活率超过90%。
5 F- P, H; o) h% a6 B; l2. 我觉得没问题，重要的是DCCIK数目增加，你IL2的浓度是多少？8 W5 r% d' W% r) F0 x6 a, r
3. 培养液不要超过培养瓶总体积的三分之一。
0 @  i6 Y: Z; O' Z4 ~7 P9 N3 r4. 目前来说，加自体血清的效果，DC和CIK细胞数目增殖远比无血清培养体系的好。

hyg5481655

回复 lzlmiranda 的帖子# x3 C( I" L$ x3 h% J* x2 p
# y5 A4 s* K$ B( _+ n
谢谢您的回复，说一下自己的看法
/ V5 j/ ]$ n3 v5 c( q' c; B1. 这份血样双阳率可以，但是我也觉得P1群外的碎片有些多，至于这些细胞碎片会不会引起病人不良反应我不是学医的不清楚。. ~- l5 u5 M* {: i% Z
2. 补充一点血样是健康人的，活力不会太差，应该是培养体系的问题，方法是经典的，IL-2的浓度我们打算分组做做看效果。我们的细胞密度在2*10^6/ml，细胞密度会不会有点太大？
7 `! X0 c: V" Q4 ^2 ?- v; M1 \$ A3. 有人推荐液体的高度在1.2cm以下，培养瓶加多点液体应该也不会对细胞密度影响太大。$ J$ u+ s  G2 m. L7 P" O8 i
4. 加点自体血清试试。

David_Chu

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/ s( q0 X3 _3 O) v$ T/ f请问老师，细胞成团，你们是如何计数的呢？是强行把它吹散，还是有其他更好的方法？前几天细胞成团很厉害，是否说明增殖很厉害呢？我觉得不能等同。细胞在第几天开始会自行分散开来呢？

hyg5481655

回复 lyj-0017 的帖子0 ^) D- q# \$ U( I! ?. S/ V

0 G1 w5 b" B; `) m& E1 C1. P1群之外的那些细胞碎片的数目有点多，有50%多，不知道是否会影响病人状况。  R5 U: B8 c2 [
2. 这个数目很奇怪，之前的PBMC数的时候有部分红细胞，但是比例不会大，数量级应该没问题。
8 c5 z( W+ g3 T3 U* F, \2 {3. 我们看颜色一变黄就补液，到后面1天一补了。

hyg5481655

回复 yuanyecat 的帖子0 z8 K. X+ h6 U; l9 ]  x
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1. T细胞群外的那些细胞碎片对人体影响大么？Treg后面会检测。
6 j( R5 i6 Z4 L" q/ o$ V2. IL-2 300IU/ml，不明原因导致细胞数增殖慢，而且D14的时候细胞团还有很多，有的很大，是否正常？

lyj-0017

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细胞成团要分情况而定的，有的细胞成团需要每天吹散，否则细胞容易死掉；有的成团的是细胞已经死掉了，吹都是吹不开的，并且团块会包裹活细胞，这样的细胞可能长不起来；还有些细胞团，其实无需吹散，如果不动细胞，过几天就自动长开了。你没拍图片，不知道你是哪种情况，所以不好界定。

lyj-0017

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1、你那个图里面除了P1，左面那部分也还是活细胞，淋巴细胞表型检测，没见过阈值调得很高的，这样会把原本是活细胞的部分信号也切掉。如果检测发现碎片很多，有的病人会因此发生副作用。
5 ?1 K: u3 w1 A% W: p4 [2、要么就是计数PBMC时计错了，要不14天的时间不可能在表型不低的情况下，细胞数目反而减少。
' @* z1 ?/ A5 J- b1 b5 g% A' Y3、根据你的描述，如果到14天时，细胞团还是很大，这就不正常，可能是增殖有问题。