探讨DC-CIK的培养

hyg5481655

前几天在论坛上发了两篇CIK培养不好的帖子，广大坛友提出了不少建议和意见，非常感谢。今天的结果出来了（x-vivo无血清，OKT3 50ng/ml，IL-300IU/ml，D8天混合）贴出来供大家评价，本人也有几点疑问想和大家探讨。$ I( k+ y  f1 t0 e, I$ I& ?
之前D14的结果：
- [' _' n9 x; W* s4 q/ _8 z( I" s
这次D14天结果：3 t/ T! a& ~" H/ z0 S& G

  ], g0 a5 O% k! X2 b' X, g
8 B! m& g: \6 F9 S: s( ]两图是用了旧的OKT3（怀疑有问题）和新OKT3的结果，差别不大，所以不是OKT3的问题。3 P" v. P5 F0 `: ?: U. r
IL-2换了一批新的，所以怀疑是以前的IL-2有问题。
7 c1 B/ @6 b8 j" b. m现有几个问题请教坛友：# O& \# q1 F5 K
1. 今天的流式结果可以看到我调高了FSC阈值，使碎片所占比例减少，相当于提高淋巴细胞群占所有events的比例，40%多，这个数据是否满足回输要求？
6 V- d# q5 O1 T' Y; k2 {8 `* ]3 A. u2. 细胞的数目不多。80ml的外周血提PBMC的时候计数为2*10的8次方，最后收获的时候竟然只有1.8*10的8次方，也就是说14D里几乎没有增殖，明显还是有问题？IL-2的量是否太少？' ~& a& s  v9 ~. v$ S
3. 我们是用培养瓶培养，由于经常补液，我看到操作人员用175T的瓶子里面的培养基都超过100多ml了，是否是因为液体过多影响了气体交换导致的不增殖了？培养瓶和培养袋的差别大吗？" A  c# v2 {, O! A! I! m
4. 无血清培养体系和加少量血清（2%、5%）会不会导致细胞数目质的区别？这种情况加2%的血清就会让细胞数目的增长有几十倍？

hyg5481655

回复 lzlmiranda 的帖子! ]& g, [+ G4 \" j
1 [( R0 T2 |( z6 k- K
如果我们能做到95%估计也就没这样那样的问题了。) q7 {4 f) q- O. a
上面那群应该是死细胞，前几天的样本做了一下分析：
) ?; l- Y, x1 L1 S同型对照和样本：; o- c% Z" ^" ~" g3 r

; D  h$ }$ s: B) L7 u, D% `# x7 J
可见绿色群CD3CD56双阴性0 t. p. Q# A- b( i; x
做了一个凋亡的双染检测
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# S# {* u, e* ?9 h' D
7 y0 y. [8 D. ^5 u$ d+ M- w可见即使不染荧光染料红色群也有非特异性荧光，样本组显示了大量处于晚期凋亡的细胞，而不是之前发帖说的坏死，肯定是有某种不利于细胞正常增殖的因素在作怪，问题是我们不知道问题出在哪里。
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hyg5481655

回复 老姜 的帖子$ @- E. Q& {' a& r2 x
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谢谢您的回复。

lzlmiranda

回复 hyg5481655 的帖子( l- z4 ?, _) f7 i1 H
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1，我检查了一下我们的流式结果，LYM占到全部的95%以上，你结果里两群细胞比例太分散，现在还不好说那些成分是什么，我觉得不一定是碎片。$ b- y7 Y. r' v+ v; n7 v1 f; L" j/ L
2，培养体系你还是按照公开的方法来摸索，培养基用X-vivo，或者takara，等等。接种的细胞密度控制在1-1.5*10^6/ml，长到什么样的密度开始补液，你自己要摸索一下，和你用的培养基有关系。
; |6 g3 U2 B  I: B) K3，瓶里培养基的体积没那么要求精确，corning或者NUNC的175培养瓶都可以加到125-150ml。
! U+ d# ^! X  z" d$ R( n4，你说的应该是自体灭活血浆，浓度控制在5%以内，一般是2%，自体血清在我们这一行是采不到也不够用的。

老姜

个人见解：
) o5 L& g" a" O/ m9 j7 v6 e: u' z1 培养瓶与培养袋的用途有别。当研究用细胞量不太大时用培养瓶即可，当进行人体输注用CIK细胞时，必须转入培养袋中培养，才能使细胞扩增达到治疗的数量。康宁公司的不同容量培养瓶侧边均标有最大容量，当培养细胞超过该容量就需转入大一号的容量瓶中培养细胞。当用于治疗量的细胞超过200mL时，均应转入培养袋中培养。最初将培养袋一折二，细胞在半个培养袋中培养，当培养液体大于500mL时，将培养袋展开培养细胞。培养袋的材料是透气的，培养细胞良好。9 y( I' T9 u" Z5 ]% c2 |7 x8 q
2 CIK细胞培养3天后，出现圆形的细胞团，说明细胞呈增殖状态。添液前用刻度吸管轻轻吹散则利于细胞的高效扩增。若是培养袋则可轻轻摇动培养袋使细胞散开。不主张成团状添液。

lyj-0017

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% I  i' C6 l- V0 J( i% b) d
# G( B/ f1 G4 x. C) |: K1、你那个图里面除了P1，左面那部分也还是活细胞，淋巴细胞表型检测，没见过阈值调得很高的，这样会把原本是活细胞的部分信号也切掉。如果检测发现碎片很多，有的病人会因此发生副作用。* l# a$ {) p! r7 w( v* F- w
2、要么就是计数PBMC时计错了，要不14天的时间不可能在表型不低的情况下，细胞数目反而减少。
( j$ t  l" S) `% Q1 t0 D3、根据你的描述，如果到14天时，细胞团还是很大，这就不正常，可能是增殖有问题。

lyj-0017

回复 David_Chu 的帖子
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细胞成团要分情况而定的，有的细胞成团需要每天吹散，否则细胞容易死掉；有的成团的是细胞已经死掉了，吹都是吹不开的，并且团块会包裹活细胞，这样的细胞可能长不起来；还有些细胞团，其实无需吹散，如果不动细胞，过几天就自动长开了。你没拍图片，不知道你是哪种情况，所以不好界定。

hyg5481655

回复 yuanyecat 的帖子
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9 Y5 Q9 x4 ^* I1. T细胞群外的那些细胞碎片对人体影响大么？Treg后面会检测。
0 V4 U1 J1 c# H! G" }2. IL-2 300IU/ml，不明原因导致细胞数增殖慢，而且D14的时候细胞团还有很多，有的很大，是否正常？

hyg5481655

回复 lyj-0017 的帖子
. b, t) `6 ]7 \3 E& z3 ~+ |# s
$ K1 H$ n, F' k+ w) n2 ~  ^1. P1群之外的那些细胞碎片的数目有点多，有50%多，不知道是否会影响病人状况。0 [& L+ y& `5 m" }2 f2 s! w
2. 这个数目很奇怪，之前的PBMC数的时候有部分红细胞，但是比例不会大，数量级应该没问题。8 n" r# Z' D( o; u, f
3. 我们看颜色一变黄就补液，到后面1天一补了。

David_Chu

回复 lyj-0017 的帖子. J& s' @2 m4 L$ }

* j; o3 f. m/ W, ?2 n- A8 v: M  D请问老师，细胞成团，你们是如何计数的呢？是强行把它吹散，还是有其他更好的方法？前几天细胞成团很厉害，是否说明增殖很厉害呢？我觉得不能等同。细胞在第几天开始会自行分散开来呢？