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总RNA提取（TRIZOL法）
, V) A) q9 p5 h o$ u1.主要试剂及配方
# w; q8 B: K9 Z O/ r+ xTRIzol® Reagent SKU# 15596-018
- B3 N( C7 o, ^* Y6 }实验所需但试剂未提供的物品：
3 O# E9 w" r' m) l+ ^9 Q, C* 氯仿 （专用）
* d# P1 K4 g3 N! J* 异丙醇 （专用） B& R% X7 L! {: F+ H
* 75%乙醇(用高压DEPC水配制) （专用）
. r5 z1 q0 U8 C* ?* |* 高压DEPC（将DEPC加入水中至0.1% (v/v)，vortex搅拌过夜，高压灭菌121度20分钟）
7 a" B9 B5 {) B9 _% E5 s0 e4 j& \6 |% J5 W& g
2.主要仪器) |, S& O# i" V: z
1.5ml Eppendorf管（RNase-free）、 Tips（RNase-free）、离心机、移液器
* A3 H1 q+ r- j @* g5 q) m
* z& h! v, C9 z( M4 ` n4 ~. | D+ L3.实验步骤; f3 L' G# ]) O. S3 u& [+ D2 n; S
㈠总RNA的提取
5 Q' e0 U7 C' L% c1.匀浆，加入TRIZOL，匀浆或充分混匀至少5分钟（组织匀浆需在冰上操作）" M4 u# s7 I X9 j0 s
a. 组织：用glass-Teflon®或强力匀浆器搅匀组织样品，每50—100mg组织加1mlTRIZOL。匀浆时组织样品容积不能超过TRIZOL容积的10%。 . c1 v( U- y* }1 @: C
注：用匀浆器（或研钵）研磨组织时，匀浆至无可见组织颗粒，室温放置5min，然后移到离心管中。操作需在冰上进行。
S3 s: I+ O, z2. 加入氯仿（0.2ml氯仿/ml Trizol），震荡混匀（用手剧烈震荡约15秒），室温静置2－3min；+ a: x0 m A! G" B1 Y: Q0 H+ b
3. 12，000×g，4℃离心15 min；6 k) O8 N/ n' R9 _( G* G
4. 吸取上层水相，至另一离心管中。注：千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相存于4℃冰箱,若只提RNA，则弃下层酚相。0 ^; G% _( }; m1 I" I* \: W
5. 加入异丙醇（0.5ml /ml Trizol），室温静置10min沉淀RNA；& M& n' `/ ?, {+ L( n
6. 12，000×g，4℃离心10 min收集沉淀； ]! k5 b2 a" b# h' q5 v. R: _! k5 G+ D
7. 75％乙醇漂洗沉淀7，500×g，4℃离心5 min；
- I! z7 F' j' r' O) K' \可将离心管甩一下，然后用枪头洗掉残留的75％乙醇，再进行室温晾干。/ u; Y4 _& q. O/ e6 v9 I( J( G( W7 w
8. 室温晾干或真空干燥5-10min。 注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。
6 E" J: v: l; l$ g9.用H2O溶解RNA样品，55-60℃,助溶5-10min。注：H2O须用DEPC处理并高压。测O.D值定量RNA浓度) I$ O* T3 c! }1 J9 `: R& g( O
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发表于 2015-8-18 09:53
