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总RNA提取（TRIZOL法）
$ q+ A: Z1 _3 a' {; g+ l1.主要试剂及配方& K- Z: m$ b' o5 Z# i
TRIzol® Reagent SKU# 15596-018 8 h- k: e& {; U5 z8 N. E0 T0 Z7 P$ u
实验所需但试剂未提供的物品： # y3 V# J9 Z0 q% x
* 氯仿 （专用）
5 X6 ]. Q+ ]$ A( f* 异丙醇 （专用）
% o" A# V3 r5 Z% I* 75%乙醇(用高压DEPC水配制) （专用）! r. o( _3 e. s1 Y
* 高压DEPC（将DEPC加入水中至0.1% (v/v)，vortex搅拌过夜，高压灭菌121度20分钟）
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2 d% m3 a, i5 B M& M U) E6 j5 F; z2.主要仪器
" q1 _- y' ]. g% R7 m' z8 b& u 1.5ml Eppendorf管（RNase-free）、 Tips（RNase-free）、离心机、移液器( i' J5 `0 F0 H# U9 b$ Q
! {1 X: e+ {- d& g: q0 \3.实验步骤
2 Z K9 Q3 G8 H㈠总RNA的提取+ B3 \# ^- ^* B4 ~2 p' ]4 e' r! D
1.匀浆，加入TRIZOL，匀浆或充分混匀至少5分钟（组织匀浆需在冰上操作）
: k" z" i. [' J, R! o( w+ ja. 组织：用glass-Teflon®或强力匀浆器搅匀组织样品，每50—100mg组织加1mlTRIZOL。匀浆时组织样品容积不能超过TRIZOL容积的10%。 . d9 @: A. Z/ i2 s6 W6 ?, K! Z
注：用匀浆器（或研钵）研磨组织时，匀浆至无可见组织颗粒，室温放置5min，然后移到离心管中。操作需在冰上进行。( w: T( W4 u, S" G7 o, ^* Z+ t
2. 加入氯仿（0.2ml氯仿/ml Trizol），震荡混匀（用手剧烈震荡约15秒），室温静置2－3min；
5 w( q/ t' X/ c6 U3. 12，000×g，4℃离心15 min；! q. f, t2 K5 {7 {
4. 吸取上层水相，至另一离心管中。注：千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相存于4℃冰箱,若只提RNA，则弃下层酚相。
, G6 l- j/ F3 s( t, [5. 加入异丙醇（0.5ml /ml Trizol），室温静置10min沉淀RNA；1 G/ J5 p% `! ^! _
6. 12，000×g，4℃离心10 min收集沉淀；, ~9 g; P8 @ g: G0 c5 H! |6 x, G
7. 75％乙醇漂洗沉淀7，500×g，4℃离心5 min；8 ]' Y8 K! m. e/ c: _
可将离心管甩一下，然后用枪头洗掉残留的75％乙醇，再进行室温晾干。' M5 }3 D. L/ [
8. 室温晾干或真空干燥5-10min。 注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。5 v* N5 ~: Y* z) f9 w' r7 h
9.用H2O溶解RNA样品，55-60℃,助溶5-10min。注：H2O须用DEPC处理并高压。测O.D值定量RNA浓度
7 x$ H! d; I& p3 P7 Q* W |
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发表于 2015-8-18 09:53
