细胞分离问题

Anne_Yu

做细胞分离的时候，离心机没有设置好升降系数，结果离心完后，血清、细胞、分离液都混在一起了，于是又重新分离了10分钟，出来后隐约可以看到细胞层，直接吸取那层细胞进行培养。想请教一下大家，在做实验的时候有没有遇到这样的情况，还有出现这种情况后应该这样处理比较好？

baby00000003

虽然不曾经历过，我大约可以这样处理吧
. f% ^) P9 w$ n# j" m! P$ W1，大比例用PBS稀释，比如1:5或者更大，然后混匀，破坏掉密度梯度
% l) K6 l- }3 u5 x6 h2，离心，离足够长时间，把各种细胞都离下去，上清扔掉- i( P: d6 o7 t7 O2 P6 L1 K
3，重新加分离液，如果是全血分离液的话血清部分先用PBS补足
7 s/ w" v4 \) m8 t0 w0 }4，分离液protocol照做就好了吧？

小刘

淋巴细胞分离液分离的主要成分是葡聚糖与泛影酸葡甲胺，它们按一定比例混合，调整比重pH 值和渗透压，经过澄清及除菌过滤后制成一种密度在 1.077g/ml 并且近于等渗的溶液（分层液） ，经过密度梯度离心使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离；如果混合比例不合理，或者其他参数不在相应范围内，从而会导致分离效果不好，或者不清晰，所以大批量分离小效果不好要及时反馈厂家或者更改制备工艺，切记有一点淋巴细胞分离液要避光保存，还有开封后的分离液一定要保存在4度并且在一周内用完。出现那情况有以下几种可能和处理方法：1.离心参数可以设置900g 20min，可以将其分离开来，2.要么是你设置的慢升慢降参数有问题，3.其次就用的分离液有问题，具体问题具体分析，你再找原因，你说最后可以分离出来白细胞，那证明患者的血是没有问题的，是你操作的原因，望采纳。

luoan

同问，有没有经历过离心后分不开的，上边血清，下面分离液，再下面红细胞，中间没有一层淋巴细胞。这种情况有什么方法可以解决，怎么补救？有经验者分享下呗。

小刘

这个问题，理论上有好几种因素：1.你加入稀释后血液到淋巴细胞分离液中时将平静 的分离液面破坏了，导致分层不清晰；2.你设置的参数太小，密度梯度离心分不开来，导致血细胞跟白膜层混到一起，增加离心转数或者离心时间；3.你使用的细胞分离液有问题，注意检查；4.就是患者服用某种药物导致血液成分改变影响分离效果。只能帮到这了，不要叫我爱因斯坦，请叫我雷管，呵呵

Anne_Yu

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谢谢！是我操作的问题，离心机升降参数，没有设置好，平时设置好是不会的。应该是升降速度太快，分离好又混了？

Anne_Yu

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. Q3 g3 H# e5 v( y- z/ l
1 C( L$ d4 v7 B" W" k% p" Z4 v谢谢！分离出来红细胞层是比较明显的，这样子直接取上面的液体进行操作就好，是吧？

Anne_Yu

回复 小刘 的帖子, u* S* G9 Z% J) ^- ~1 n' d' w
% _! ]3 _- x& S1 h8 Z7 U
谢谢！原因是设置的离心机升降速度过快，可能升的时候太快破坏了分离液面，降的时候太快又把细胞层混了？平时设置好是不会的。

baby00000003

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这个....无图无真相，不敢瞎说哈～

本心

降速时间调到最大可能有效果