【讨论】骨髓间充质干细胞分离、培养及传代问题

lizhen

现在正在养猪和人的骨髓间充质干细胞，遇到一些问题，也查了园内一些资料，但是说法不一，在此提出请大家帮助：: ]& k- w. O+ b# ]: I
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1. MSCs用percoll法分离的时候，首次离心的时候转速需要多少，我用的是800g/30min，（我看有的是900g/15min，还有其它的，是不是根据物种有所不同）。离心的时候温度需要控制在多少，是室温还是4度，如果是室温，随着离心是不是温度会逐渐升高？
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2. 骨髓向Percoll分离液加样离心后，出现4层结构，然后是用吸管把上层的血清吸走在吸取单个核细胞层，还是直接把吸管伸进夜间吸取单个核细胞层？
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8 f+ S& @% J- {* ~+ e7 k3. MSCs传代的时候，终止消化吹打混匀后是需要离心还是直接分别接种到新的培养瓶中，有人说需要离心是洗掉EDTA，也有人说没有必要因为培养基中的Ca会与EDTA螯合使其失效，离心反而会伤害细胞，大家传代的时候用不用离心，参数如何?
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" u8 T% {& E5 i+ M4. 人的MSCs与猪的分离方法有什么区别？我作猪的可以分离出厚厚的一层细胞，而人的采用相同的方法（只是percoll配的密度不一样）只有薄薄一层，不知道大家有什么经验？

君鸿

我是做胎盘间充质干细胞的，我们已经在供临床使用了，技术已经比较成熟了，我们从胎盘分离出的时候，用percol分离时是1500R，20度，15分钟，我们取中间的灰白层，直接吸，不用吸上清，后面用PBS重悬再次离心即可。传代时技术需要离心，用培养基重悬均分即可。

RIVA2011

首先：
+ `. m( \; L% }/ N3 m我们是这样做的
+ h6 j; @$ `7 p% h% D. `. O& T1. 首次离心的时候转速2000rpm  15min，传代离心1000rpm 离心的时候温度4度，至于是多少，我认为离心时间不长对细胞的影响不大。$ S1 _5 |8 C) n4 n, {. _
2. 至于用吸管把上层的血清吸走在吸取单个核细胞层，还是直接把吸管伸进液间吸取单个核细胞层，这不是关键，关键是不要吸到杂质细胞。; j5 [% u5 Y  O4 @: q: f
3. 消化后，为了避免残留的胰酶等对细胞生长。我们要离心。
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wangweilie0418

不好意思，首次离心式2500r，20min

wangweilie0418

      我们做人的MSC，首次离心式r，25min，吸取白膜层的时候是直接取。不过我们的分离液用的是ficoll。至于传代时我们一直是离心的，这样可以去除残留的胰酶等对细胞生长没有帮助的杂志。

神经干

1首次离心用常温就可以了，我们之前分骨髓单个核细胞比较过4度和常温，差别不太大，离心时温度会逐渐升高的。
6 }- n7 Z3 w; n2以我的经验觉得先吸掉上清比较好，因为你不能保证在吸单个核时不吸到上层液体，如果熟练了可以直接吸的，看你个人了，这个应该没有什么硬性规定吧8 h5 O$ A, c4 x* g9 X% e. t
3传代时以1000r离心，因为胰酶中可能含有损伤细胞的物质，影响细胞生长
+ V8 \; Z0 V2 D+ K9 k3 s4猪的我没做过，不过不同的人的MSC的分离分出的白膜层也是不一样的

hygene

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  S: Y; u, K, F& V2 K回复 lizhen 的帖子. m) E: h( S5 k4 O" v7 W
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1、离心1000g,10分钟，室温
% a: }; a3 k8 Y  ~7 {5 i% k2、直接伸进去吸取单核细胞层# U" Q4 Y2 v4 z( E) \. I4 s8 K
  ; }% \: F& z+ u# s* s- o+ \9 q
3、不用离心（作猪BMSCs未离心传代20多次）" m0 c& g9 j$ Q
4、从样品中分离的细胞量不一样

gact

回复 lizhen 的帖子3 \) m1 x" U; A- L6 e! [! U9 r% R
2 @6 ]3 e8 a3 a  }- `- o
你在做猪的MSC么？$ u& a4 v6 G& e( S
怎么采集骨髓的么？
+ l( {7 n. o& Z用什么型号的骨刺针？

smartrabbit

我以2000rpm/min,20min离心，我们实验室的人传代时不离心，直接传代，细胞状态很好

hbling2003

我分离人骨髓间质干时，首次离心为2000rpm/min,20min. 温度最好设置在20℃左右，吸取单个核细胞层时，直接将吸管插入到细胞层吸取，避免吸取到下面的粒细胞层和红细胞。传代的时候最好在低速下离心洗涤除去消化液，800—1000转/分