【讨论】骨髓间充质干细胞分离、培养及传代问题

lizhen

现在正在养猪和人的骨髓间充质干细胞，遇到一些问题，也查了园内一些资料，但是说法不一，在此提出请大家帮助：
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1. MSCs用percoll法分离的时候，首次离心的时候转速需要多少，我用的是800g/30min，（我看有的是900g/15min，还有其它的，是不是根据物种有所不同）。离心的时候温度需要控制在多少，是室温还是4度，如果是室温，随着离心是不是温度会逐渐升高？7 b% Q& C; k. {: q4 C4 ?

9 {/ ~; D# z) _: S, g' ]5 F0 f( V7 \: V2. 骨髓向Percoll分离液加样离心后，出现4层结构，然后是用吸管把上层的血清吸走在吸取单个核细胞层，还是直接把吸管伸进夜间吸取单个核细胞层？
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2 S4 L0 u6 R$ M" w. ~; A$ e3. MSCs传代的时候，终止消化吹打混匀后是需要离心还是直接分别接种到新的培养瓶中，有人说需要离心是洗掉EDTA，也有人说没有必要因为培养基中的Ca会与EDTA螯合使其失效，离心反而会伤害细胞，大家传代的时候用不用离心，参数如何?
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0 }5 u: l1 }( p: L( Q4. 人的MSCs与猪的分离方法有什么区别？我作猪的可以分离出厚厚的一层细胞，而人的采用相同的方法（只是percoll配的密度不一样）只有薄薄一层，不知道大家有什么经验？

君鸿

我是做胎盘间充质干细胞的，我们已经在供临床使用了，技术已经比较成熟了，我们从胎盘分离出的时候，用percol分离时是1500R，20度，15分钟，我们取中间的灰白层，直接吸，不用吸上清，后面用PBS重悬再次离心即可。传代时技术需要离心，用培养基重悬均分即可。

RIVA2011

首先：
  l4 r% _2 i5 g: p3 O我们是这样做的6 k4 q- h$ w9 M( u
1. 首次离心的时候转速2000rpm  15min，传代离心1000rpm 离心的时候温度4度，至于是多少，我认为离心时间不长对细胞的影响不大。$ g9 A9 `. e  ^: M3 @1 g/ ~
2. 至于用吸管把上层的血清吸走在吸取单个核细胞层，还是直接把吸管伸进液间吸取单个核细胞层，这不是关键，关键是不要吸到杂质细胞。
& M5 i% S  E" Z+ H! ~; Z' k2 `3. 消化后，为了避免残留的胰酶等对细胞生长。我们要离心。
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wangweilie0418

不好意思，首次离心式2500r，20min

wangweilie0418

      我们做人的MSC，首次离心式r，25min，吸取白膜层的时候是直接取。不过我们的分离液用的是ficoll。至于传代时我们一直是离心的，这样可以去除残留的胰酶等对细胞生长没有帮助的杂志。

神经干

1首次离心用常温就可以了，我们之前分骨髓单个核细胞比较过4度和常温，差别不太大，离心时温度会逐渐升高的。
' P! Y$ y: F. n* d8 V2以我的经验觉得先吸掉上清比较好，因为你不能保证在吸单个核时不吸到上层液体，如果熟练了可以直接吸的，看你个人了，这个应该没有什么硬性规定吧6 _/ p. y3 t% d" D
3传代时以1000r离心，因为胰酶中可能含有损伤细胞的物质，影响细胞生长  `2 O, m$ u' U. T
4猪的我没做过，不过不同的人的MSC的分离分出的白膜层也是不一样的

hygene

) O) J- m% E4 \) s# U  |# I' i. c2 d' o0 Z) d/ h
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1、离心1000g,10分钟，室温
) R' o; K  o! ]" S5 O2、直接伸进去吸取单核细胞层
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3、不用离心（作猪BMSCs未离心传代20多次）# J2 n1 ?% W7 p1 Z4 Z- w; d4 V
4、从样品中分离的细胞量不一样

gact

回复 lizhen 的帖子7 [, T6 E" e0 x  R& b

  Z% l1 ?+ K3 K& s/ p7 {. x. f你在做猪的MSC么？
0 A$ ?2 s& L8 T6 s) A怎么采集骨髓的么？- p: i( n. w$ K  M. T7 ]9 x
用什么型号的骨刺针？

smartrabbit

我以2000rpm/min,20min离心，我们实验室的人传代时不离心，直接传代，细胞状态很好

hbling2003

我分离人骨髓间质干时，首次离心为2000rpm/min,20min. 温度最好设置在20℃左右，吸取单个核细胞层时，直接将吸管插入到细胞层吸取，避免吸取到下面的粒细胞层和红细胞。传代的时候最好在低速下离心洗涤除去消化液，800—1000转/分