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【讨论】骨髓间充质干细胞分离、培养及传代问题 [复制链接]

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发表于 2009-4-20 11:53 |只看该作者 |正序浏览 |打印
现在正在养猪和人的骨髓间充质干细胞,遇到一些问题,也查了园内一些资料,但是说法不一,在此提出请大家帮助:, x) V* u6 h$ k5 @- M; ^
8 ^* m3 `6 q( U. N2 Q+ Q
1. MSCs用percoll法分离的时候,首次离心的时候转速需要多少,我用的是800g/30min,(我看有的是900g/15min,还有其它的,是不是根据物种有所不同)。离心的时候温度需要控制在多少,是室温还是4度,如果是室温,随着离心是不是温度会逐渐升高?# G/ j& v0 o  \! U# X- n

* h9 x0 q6 p# H! d& H' S& h2. 骨髓向Percoll分离液加样离心后,出现4层结构,然后是用吸管把上层的血清吸走在吸取单个核细胞层,还是直接把吸管伸进夜间吸取单个核细胞层?8 {. W) Q8 C7 O6 t4 e# P

% q. h7 Z3 Y  S7 u3. MSCs传代的时候,终止消化吹打混匀后是需要离心还是直接分别接种到新的培养瓶中,有人说需要离心是洗掉EDTA,也有人说没有必要因为培养基中的Ca会与EDTA螯合使其失效,离心反而会伤害细胞,大家传代的时候用不用离心,参数如何?
- c: R2 M* X4 N) p2 N, }! ^5 y6 I( N$ y' o# q) T  l- Y8 Q
4. 人的MSCs与猪的分离方法有什么区别?我作猪的可以分离出厚厚的一层细胞,而人的采用相同的方法(只是percoll配的密度不一样)只有薄薄一层,不知道大家有什么经验?

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发表于 2011-8-29 09:07 |只看该作者
我是做胎盘间充质干细胞的,我们已经在供临床使用了,技术已经比较成熟了,我们从胎盘分离出的时候,用percol分离时是1500R,20度,15分钟,我们取中间的灰白层,直接吸,不用吸上清,后面用PBS重悬再次离心即可。传代时技术需要离心,用培养基重悬均分即可。
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发表于 2011-8-25 13:33 |只看该作者
首先:# j' H* d7 `- O: k2 b& @
我们是这样做的
3 A6 T# R# k* s3 m- k1. 首次离心的时候转速2000rpm  15min,传代离心1000rpm 离心的时候温度4度,至于是多少,我认为离心时间不长对细胞的影响不大。
2 w! X: A& B! S2. 至于用吸管把上层的血清吸走在吸取单个核细胞层,还是直接把吸管伸进液间吸取单个核细胞层,这不是关键,关键是不要吸到杂质细胞。) j. v$ F9 ^8 l3 M
3. 消化后,为了避免残留的胰酶等对细胞生长。我们要离心。6 n; a0 q( e# b( I/ |' h) O! Z
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发表于 2011-8-24 10:25 |只看该作者
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不好意思,首次离心式2500r,20min

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发表于 2011-8-24 10:24 |只看该作者
      我们做人的MSC,首次离心式r,25min,吸取白膜层的时候是直接取。不过我们的分离液用的是ficoll。至于传代时我们一直是离心的,这样可以去除残留的胰酶等对细胞生长没有帮助的杂志。
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发表于 2011-8-24 08:22 |只看该作者
1首次离心用常温就可以了,我们之前分骨髓单个核细胞比较过4度和常温,差别不太大,离心时温度会逐渐升高的。: h% p- e. v& x. S' H& ~8 Q2 ]0 s
2以我的经验觉得先吸掉上清比较好,因为你不能保证在吸单个核时不吸到上层液体,如果熟练了可以直接吸的,看你个人了,这个应该没有什么硬性规定吧7 f( ~& C+ R  p) |# E$ r. y) _
3传代时以1000r离心,因为胰酶中可能含有损伤细胞的物质,影响细胞生长
$ \, c2 x0 N$ Q" i4猪的我没做过,不过不同的人的MSC的分离分出的白膜层也是不一样的
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发表于 2011-8-23 22:17 |只看该作者
本帖最后由 细胞海洋 于 2011-8-24 01:09 编辑 % N8 a; e, R4 q1 B4 P
6 }# ]+ U+ b. U9 U5 Y# W' t
回复 lizhen 的帖子' B# V& O" [% g7 n
  [8 K6 O8 T1 H! V) O4 W$ N; n4 C
1、离心1000g,10分钟,室温
3 l2 w8 Z6 O: _. D' h% M0 m2、直接伸进去吸取单核细胞层8 l# s# q* {+ r0 Q6 b' J: q
  
0 S3 m, g7 j) }- F4 d  M3、不用离心(作猪BMSCs未离心传代20多次)" a) J0 T' ]0 `/ @- t: l
4、从样品中分离的细胞量不一样
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报纸
发表于 2011-8-23 19:18 |只看该作者
回复 lizhen 的帖子
5 {8 Q0 \' B; _- U9 y- Z8 H) Q9 \& z! T+ [9 I4 i
你在做猪的MSC么?
! F) g. h5 @8 `9 m1 A/ c怎么采集骨髓的么?
) O& }* A) p. v# u用什么型号的骨刺针?
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板凳
发表于 2009-6-19 15:51 |只看该作者
我以2000rpm/min,20min离心,我们实验室的人传代时不离心,直接传代,细胞状态很好
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藤椅
发表于 2009-5-6 21:04 |只看该作者
我分离人骨髓间质干时,首次离心为2000rpm/min,20min. 温度最好设置在20℃左右,吸取单个核细胞层时,直接将吸管插入到细胞层吸取,避免吸取到下面的粒细胞层和红细胞。传代的时候最好在低速下离心洗涤除去消化液,800—1000转/分
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