【讨论】骨髓间充质干细胞分离、培养及传代问题

lizhen

现在正在养猪和人的骨髓间充质干细胞，遇到一些问题，也查了园内一些资料，但是说法不一，在此提出请大家帮助：- ?* W: G+ E; q/ E5 y% l; N
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1. MSCs用percoll法分离的时候，首次离心的时候转速需要多少，我用的是800g/30min，（我看有的是900g/15min，还有其它的，是不是根据物种有所不同）。离心的时候温度需要控制在多少，是室温还是4度，如果是室温，随着离心是不是温度会逐渐升高？
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2. 骨髓向Percoll分离液加样离心后，出现4层结构，然后是用吸管把上层的血清吸走在吸取单个核细胞层，还是直接把吸管伸进夜间吸取单个核细胞层？' \, M! P4 ^/ [: B" A9 ~& H
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3. MSCs传代的时候，终止消化吹打混匀后是需要离心还是直接分别接种到新的培养瓶中，有人说需要离心是洗掉EDTA，也有人说没有必要因为培养基中的Ca会与EDTA螯合使其失效，离心反而会伤害细胞，大家传代的时候用不用离心，参数如何?9 G# Z/ l5 ]3 J9 z" n
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4. 人的MSCs与猪的分离方法有什么区别？我作猪的可以分离出厚厚的一层细胞，而人的采用相同的方法（只是percoll配的密度不一样）只有薄薄一层，不知道大家有什么经验？

wojoo

1）离心1000/5min/RT) O& {) G4 [7 s4 N+ U  A$ ~$ v
2)可以直接吸取  I- U7 L, n3 ^, O% |+ P) k) U) H
3）应该离心，消化后液体中有酶和EDTA，必需去处

hbling2003

我分离人骨髓间质干时，首次离心为2000rpm/min,20min. 温度最好设置在20℃左右，吸取单个核细胞层时，直接将吸管插入到细胞层吸取，避免吸取到下面的粒细胞层和红细胞。传代的时候最好在低速下离心洗涤除去消化液，800—1000转/分

smartrabbit

我以2000rpm/min,20min离心，我们实验室的人传代时不离心，直接传代，细胞状态很好

gact

回复 lizhen 的帖子
9 O  ?) R; k7 {* l; j$ r- p
) Y$ f5 f" B$ r7 e5 B- J0 G7 n. v+ b你在做猪的MSC么？
0 a5 p* [# b/ b/ s怎么采集骨髓的么？+ r  T& o* ~) ^  i" g, {  O* U
用什么型号的骨刺针？

hygene

1 r1 `! Q9 `4 K1 h; g8 T9 }, Y) H, }
" m& D) o+ }! N1 T9 t回复 lizhen 的帖子
: L3 [( \- Q* d% z) ^5 n' k: |6 X4 L) I6 L2 j3 e+ x
1、离心1000g,10分钟，室温
0 q2 [# [5 j- p( X+ ?5 k  ]2、直接伸进去吸取单核细胞层
3 ]& M$ j3 H( N8 ~( H7 P! i  
4 f6 H% a2 G, }/ a3、不用离心（作猪BMSCs未离心传代20多次）
; v1 x* g- T* v* l$ t; I4、从样品中分离的细胞量不一样

神经干

1首次离心用常温就可以了，我们之前分骨髓单个核细胞比较过4度和常温，差别不太大，离心时温度会逐渐升高的。( Y3 `% u( x5 R7 i0 A" R) ?. P
2以我的经验觉得先吸掉上清比较好，因为你不能保证在吸单个核时不吸到上层液体，如果熟练了可以直接吸的，看你个人了，这个应该没有什么硬性规定吧
0 ^5 u9 B1 ?9 X: a. `! v, u/ [4 {3传代时以1000r离心，因为胰酶中可能含有损伤细胞的物质，影响细胞生长# O8 Z+ u" H; b$ D
4猪的我没做过，不过不同的人的MSC的分离分出的白膜层也是不一样的

wangweilie0418

      我们做人的MSC，首次离心式r，25min，吸取白膜层的时候是直接取。不过我们的分离液用的是ficoll。至于传代时我们一直是离心的，这样可以去除残留的胰酶等对细胞生长没有帮助的杂志。

wangweilie0418

不好意思，首次离心式2500r，20min

RIVA2011

首先：
5 j( s/ ]* W) a/ y我们是这样做的
- j& v+ Z8 b! T" q) H- J1. 首次离心的时候转速2000rpm  15min，传代离心1000rpm 离心的时候温度4度，至于是多少，我认为离心时间不长对细胞的影响不大。1 ]' K8 U* o9 y2 {
2. 至于用吸管把上层的血清吸走在吸取单个核细胞层，还是直接把吸管伸进液间吸取单个核细胞层，这不是关键，关键是不要吸到杂质细胞。2 l, P6 o" E+ k  i" u
3. 消化后，为了避免残留的胰酶等对细胞生长。我们要离心。
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