【讨论】骨髓间充质干细胞分离、培养及传代问题

lizhen

现在正在养猪和人的骨髓间充质干细胞，遇到一些问题，也查了园内一些资料，但是说法不一，在此提出请大家帮助：
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1. MSCs用percoll法分离的时候，首次离心的时候转速需要多少，我用的是800g/30min，（我看有的是900g/15min，还有其它的，是不是根据物种有所不同）。离心的时候温度需要控制在多少，是室温还是4度，如果是室温，随着离心是不是温度会逐渐升高？3 g  B( I$ }5 Z% w& d

9 u4 m' f/ b' g! |1 r2. 骨髓向Percoll分离液加样离心后，出现4层结构，然后是用吸管把上层的血清吸走在吸取单个核细胞层，还是直接把吸管伸进夜间吸取单个核细胞层？
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& ?# `5 H' u) L- a3. MSCs传代的时候，终止消化吹打混匀后是需要离心还是直接分别接种到新的培养瓶中，有人说需要离心是洗掉EDTA，也有人说没有必要因为培养基中的Ca会与EDTA螯合使其失效，离心反而会伤害细胞，大家传代的时候用不用离心，参数如何?
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+ s) f9 y0 o. }3 z2 Y4. 人的MSCs与猪的分离方法有什么区别？我作猪的可以分离出厚厚的一层细胞，而人的采用相同的方法（只是percoll配的密度不一样）只有薄薄一层，不知道大家有什么经验？

wojoo

1）离心1000/5min/RT
# E, ?1 ^4 L' x* |1 @* ?2)可以直接吸取; }; b) N1 B) l; a
3）应该离心，消化后液体中有酶和EDTA，必需去处

hbling2003

我分离人骨髓间质干时，首次离心为2000rpm/min,20min. 温度最好设置在20℃左右，吸取单个核细胞层时，直接将吸管插入到细胞层吸取，避免吸取到下面的粒细胞层和红细胞。传代的时候最好在低速下离心洗涤除去消化液，800—1000转/分

smartrabbit

我以2000rpm/min,20min离心，我们实验室的人传代时不离心，直接传代，细胞状态很好

gact

回复 lizhen 的帖子
  p9 u% \1 H$ e6 t7 A8 {0 j% y# n5 G  U9 y* _% t; F7 ^
你在做猪的MSC么？
, g! t& Z* u  ?1 `$ m怎么采集骨髓的么？. X  b1 d7 r% L4 G7 r( J# [
用什么型号的骨刺针？

hygene

. a* C: s2 X* D, G8 k8 B) m; y: h
. g/ f+ t. u. K+ Y# H2 @回复 lizhen 的帖子
! i2 \; k5 j- c, t) F9 x" F4 I7 T7 w& O; J% w: n) O* s
1、离心1000g,10分钟，室温
$ d4 g& {8 {; L' Y2、直接伸进去吸取单核细胞层% p. T+ R) z5 U6 l, e  F) P
  
; l' v* s  _; o# z3、不用离心（作猪BMSCs未离心传代20多次）$ J' h, V$ j/ p; y( W% d
4、从样品中分离的细胞量不一样

神经干

1首次离心用常温就可以了，我们之前分骨髓单个核细胞比较过4度和常温，差别不太大，离心时温度会逐渐升高的。! T/ M, U7 p/ s$ e$ J0 h
2以我的经验觉得先吸掉上清比较好，因为你不能保证在吸单个核时不吸到上层液体，如果熟练了可以直接吸的，看你个人了，这个应该没有什么硬性规定吧0 _2 k% g+ y6 u% F- q5 ?# T7 B' A( s
3传代时以1000r离心，因为胰酶中可能含有损伤细胞的物质，影响细胞生长$ j1 x2 z5 O, f9 V8 M: z4 ~' @
4猪的我没做过，不过不同的人的MSC的分离分出的白膜层也是不一样的

wangweilie0418

      我们做人的MSC，首次离心式r，25min，吸取白膜层的时候是直接取。不过我们的分离液用的是ficoll。至于传代时我们一直是离心的，这样可以去除残留的胰酶等对细胞生长没有帮助的杂志。

wangweilie0418

不好意思，首次离心式2500r，20min

RIVA2011

首先：
* w) s. R6 s" \# K& }* ~6 F我们是这样做的7 S5 f" V% H( P* a  x; Q6 h( G
1. 首次离心的时候转速2000rpm  15min，传代离心1000rpm 离心的时候温度4度，至于是多少，我认为离心时间不长对细胞的影响不大。9 o" x( D) h0 ^; i
2. 至于用吸管把上层的血清吸走在吸取单个核细胞层，还是直接把吸管伸进液间吸取单个核细胞层，这不是关键，关键是不要吸到杂质细胞。
3 F" {3 q8 k2 _9 m4 i$ d. y" ]3. 消化后，为了避免残留的胰酶等对细胞生长。我们要离心。
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