【讨论】骨髓间充质干细胞分离、培养及传代问题

lizhen

现在正在养猪和人的骨髓间充质干细胞，遇到一些问题，也查了园内一些资料，但是说法不一，在此提出请大家帮助：; Z; K6 h0 k( z2 p8 V# Q

" ?. {. U) ]. I! v; {/ Q1. MSCs用percoll法分离的时候，首次离心的时候转速需要多少，我用的是800g/30min，（我看有的是900g/15min，还有其它的，是不是根据物种有所不同）。离心的时候温度需要控制在多少，是室温还是4度，如果是室温，随着离心是不是温度会逐渐升高？6 C* x1 I- i4 X
1 ~: ^. Y# s+ y) `5 h6 z6 d5 K
2. 骨髓向Percoll分离液加样离心后，出现4层结构，然后是用吸管把上层的血清吸走在吸取单个核细胞层，还是直接把吸管伸进夜间吸取单个核细胞层？1 h' R5 W6 G4 y

, ^2 d& |* W9 c* l- e) @3 c, j3. MSCs传代的时候，终止消化吹打混匀后是需要离心还是直接分别接种到新的培养瓶中，有人说需要离心是洗掉EDTA，也有人说没有必要因为培养基中的Ca会与EDTA螯合使其失效，离心反而会伤害细胞，大家传代的时候用不用离心，参数如何?) P+ z& z. [; Y: z, r1 C6 M5 w: S
5 q- o7 @6 V- z# T
4. 人的MSCs与猪的分离方法有什么区别？我作猪的可以分离出厚厚的一层细胞，而人的采用相同的方法（只是percoll配的密度不一样）只有薄薄一层，不知道大家有什么经验？

wojoo

1）离心1000/5min/RT% A; o; s; @  c1 s2 _9 l& l- w
2)可以直接吸取" g/ |4 f! l1 |/ a& o
3）应该离心，消化后液体中有酶和EDTA，必需去处

hbling2003

我分离人骨髓间质干时，首次离心为2000rpm/min,20min. 温度最好设置在20℃左右，吸取单个核细胞层时，直接将吸管插入到细胞层吸取，避免吸取到下面的粒细胞层和红细胞。传代的时候最好在低速下离心洗涤除去消化液，800—1000转/分

smartrabbit

我以2000rpm/min,20min离心，我们实验室的人传代时不离心，直接传代，细胞状态很好

gact

回复 lizhen 的帖子0 @# g% ~7 x0 @9 l+ Y5 |' ?! H

! t1 U: A& a8 T! ~你在做猪的MSC么？
" z3 z" j& C- o/ \怎么采集骨髓的么？
3 p& h0 T% J! M& V$ o7 i/ N用什么型号的骨刺针？

hygene

) z$ ~8 S, y1 I

* Z1 p3 i: N* W( A! ~3 X9 p) a4 o  n# X0 ^回复 lizhen 的帖子. g/ s3 p8 J# ]9 e1 c+ F

! v& C2 u. `& F. q4 L" Y" I1、离心1000g,10分钟，室温% k7 ?. G4 W; i) `
2、直接伸进去吸取单核细胞层% n' Q( G8 f& W2 v( A1 _# T
  
4 {- k) T& C3 }; R3、不用离心（作猪BMSCs未离心传代20多次）/ z6 `: ]2 y$ a. K  \
4、从样品中分离的细胞量不一样

神经干

1首次离心用常温就可以了，我们之前分骨髓单个核细胞比较过4度和常温，差别不太大，离心时温度会逐渐升高的。
; V( k- e. Z2 u; q" w" B, n4 c2以我的经验觉得先吸掉上清比较好，因为你不能保证在吸单个核时不吸到上层液体，如果熟练了可以直接吸的，看你个人了，这个应该没有什么硬性规定吧
  B2 g7 X( i/ `9 o  k" P$ ~% R/ l9 M3传代时以1000r离心，因为胰酶中可能含有损伤细胞的物质，影响细胞生长2 O0 u+ b# i/ b+ [- R* M5 o& i* [# F
4猪的我没做过，不过不同的人的MSC的分离分出的白膜层也是不一样的

wangweilie0418

      我们做人的MSC，首次离心式r，25min，吸取白膜层的时候是直接取。不过我们的分离液用的是ficoll。至于传代时我们一直是离心的，这样可以去除残留的胰酶等对细胞生长没有帮助的杂志。

wangweilie0418

不好意思，首次离心式2500r，20min

RIVA2011

首先：
; u0 h; R6 b( X我们是这样做的
6 B) o% n7 I* F2 {2 u6 x  `1. 首次离心的时候转速2000rpm  15min，传代离心1000rpm 离心的时候温度4度，至于是多少，我认为离心时间不长对细胞的影响不大。
* g$ C: I1 X' d: g) ]2. 至于用吸管把上层的血清吸走在吸取单个核细胞层，还是直接把吸管伸进液间吸取单个核细胞层，这不是关键，关键是不要吸到杂质细胞。
1 _( B, \' N4 @, G3. 消化后，为了避免残留的胰酶等对细胞生长。我们要离心。& a& Q- ~% l( E) d$ W4 g: I2 |9 q/ ~