DC-CIK共培养标准操作

御剑红尘

4.1 抽取患者外周血200ml(或机采80ml)  ，转入50ml离心管，用生理盐水按血样：生理盐水=1:1的比例稀释混匀；7 S1 {' O0 u5 A% o1 ^; ?
     4.2将淋巴细胞分离液（密度1.077）加入50ml离心管，每管加入20ml；* w' t9 _  p* ]. E
     4.3将稀释血样缓慢加到淋巴细胞分离液（上步准备好的）上面。(加样时注意：将离心管倾斜45度左右，在淋巴细胞分离液液面以上1cm左右处，缓慢加入稀释后的血样，不要打乱液液界面)。稀释血样量：淋巴细胞分离液量=1.5:1，室温下，于2000rpm(或800g) 离心20分钟，注意离心机升速和降速都调至最低；
0 I( t0 Y1 ]8 A% `9 X0 V     4.4用平口巴士吸管轻轻插入到PBMC层（即白色细胞层），沿管壁小心吸取该层细胞到另一支50ml离心管中，用生理盐水调体积至50ml混匀，1500rpm（或400g）离心6分钟洗涤2遍，洗涤最后一遍时取样计数、计算活率；
/ F' {. J! `- o6 ]* M  g3 C7 C3 p: `4.5弃上清，细胞用80mlRPMI1640培养基重悬后接入T75培养瓶中，每瓶接20ml。用记号笔做好标记（主要标记病人姓名、生产批号、接种日期、操作者姓名简写）后置37℃、5%CO2培养箱孵育1小时；
% f. u( R! |* j  X, j5 V2 D) i' D4.6轻晃培养瓶，收集悬浮细胞于50ml离心管中，然后用无血清RPMI1640培养基洗涤培养瓶中的贴壁细胞2遍，洗出的细胞与前面收集的悬浮细胞合在一起（用于制备CIK细胞），然后向培养瓶中加入DC细胞初始培养基后置于37℃、5%CO2培养箱中培养；7 a1 z4 Y" _' e; g, V' G. X
    4.7第3天开始视细胞生长情况补加DC细胞维持培养基；
4 x' r# F1 b  j8 B9 [. }: C1 G    4.8第5天加入肿瘤抗原（终浓度1%）；
$ [9 a6 {7 B3 g5 h. N) L4.9 第六天加入H，取样做细菌、真菌检测；
  k0 R% }8 @) P4 Q8 x4.10CIK培养8 @$ {: H/ h4 z- h& _0 L
4.10.1取4.6步中的非贴壁细胞用于CIK细胞的培养。离心收集细胞，用CIK初始培养基按1-2*106/ml的密度重悬细胞接种于培养瓶（少于100ml时）或培养袋（多余100ml时）中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养；* v8 r2 V/ W+ g" y, z, w' C+ g
4.10.2以后每天观察细胞状况，并根据细胞生长情况补加CIK细胞维持培养基；
& Z0 H# ^+ w- F4.11DC-CIK共培养用
6 f# p% v. j; C2 r: Q    4.11.1收集培养至第7-8天的DC细胞，按DC:IK=1;10-1;100的比例将DC细胞分配到CIK细胞中，并补加B，培养过夜后再次补加B；
" y$ ]# c) F. J8 F4.11,2以后每天观察细胞状况并根据生长情况补加CIK细胞维持培养基；
' }( V- i6 O6 m9 H    4.11.3第9天，观察细胞生长情况，预计回输日期，在预计的回输日期前2天取样做细菌、真菌、内毒素检测；) c5 c/ S; n+ a  h; z" n0 l6 z
4.12回输
/ A/ m* j% {8 C" h" o4.12.1首先观察细胞生长状况，观察有无污染，结合细菌、真菌检测结果确定是否适合回输。
8 J. Q5 S' g  G4.12.2如果适合回输则收集细胞。将适量细胞培养悬液至50ml离心管中（根据细胞总数和生长状况确定每次收集的培养悬液的体积），取样计数、计算活率。1500rpm（或400g）离心6分钟，上清留样两份，一份用于下次细菌、真菌、内毒素检测，另一份冻存于-86℃冰箱备查（保存至回输结束后三个月），其余的弃掉，沉淀在掸散后用生理盐水洗涤2遍（1500rpm离心6分钟）后用含2%人血白蛋白的生理盐水重悬至100ml，做好标记（主要表病人姓名、生产批号）后，填写好相关记录后交护理人员送病房回输。3 P* k& q3 @' L. `
4.12.3剩余细胞视情况补加CIK维持培养基继续培养用于以后几次的回输。* i9 q( f; R" A

细胞海洋

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飞翔的烨

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+ X2 s0 F2 Q( q+ F2 }  [6 U* g$ i2 p6 U( t. B
好贴，赞

wangyi111

回输的DC细胞CD80,83,86，HLA-DR多少？

121qwq

学习了