DC-CIK共培养标准操作

御剑红尘

4.1 抽取患者外周血200ml(或机采80ml)  ，转入50ml离心管，用生理盐水按血样：生理盐水=1:1的比例稀释混匀；4 ?5 I+ t5 L% Q  [5 W& Y- K
     4.2将淋巴细胞分离液（密度1.077）加入50ml离心管，每管加入20ml；
( {8 l# G! Q! K# e" P     4.3将稀释血样缓慢加到淋巴细胞分离液（上步准备好的）上面。(加样时注意：将离心管倾斜45度左右，在淋巴细胞分离液液面以上1cm左右处，缓慢加入稀释后的血样，不要打乱液液界面)。稀释血样量：淋巴细胞分离液量=1.5:1，室温下，于2000rpm(或800g) 离心20分钟，注意离心机升速和降速都调至最低；$ ]% x+ Z3 Z( g5 E! D
     4.4用平口巴士吸管轻轻插入到PBMC层（即白色细胞层），沿管壁小心吸取该层细胞到另一支50ml离心管中，用生理盐水调体积至50ml混匀，1500rpm（或400g）离心6分钟洗涤2遍，洗涤最后一遍时取样计数、计算活率；
( X: A" p  A; e0 ?4.5弃上清，细胞用80mlRPMI1640培养基重悬后接入T75培养瓶中，每瓶接20ml。用记号笔做好标记（主要标记病人姓名、生产批号、接种日期、操作者姓名简写）后置37℃、5%CO2培养箱孵育1小时；8 E6 O! l" P' q0 e) @; Y$ J: K( `
4.6轻晃培养瓶，收集悬浮细胞于50ml离心管中，然后用无血清RPMI1640培养基洗涤培养瓶中的贴壁细胞2遍，洗出的细胞与前面收集的悬浮细胞合在一起（用于制备CIK细胞），然后向培养瓶中加入DC细胞初始培养基后置于37℃、5%CO2培养箱中培养；
4 E% R5 v/ ?8 s( \7 V: J    4.7第3天开始视细胞生长情况补加DC细胞维持培养基；! T/ \: L/ ~0 h8 X6 r% Q: r
    4.8第5天加入肿瘤抗原（终浓度1%）；: b$ D, @3 ], ~. ?
4.9 第六天加入H，取样做细菌、真菌检测；: K2 U5 N! ~) W+ h7 O8 L
4.10CIK培养& ?) }; A; }: S: e
4.10.1取4.6步中的非贴壁细胞用于CIK细胞的培养。离心收集细胞，用CIK初始培养基按1-2*106/ml的密度重悬细胞接种于培养瓶（少于100ml时）或培养袋（多余100ml时）中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养；6 J- `, n9 R) t  B
4.10.2以后每天观察细胞状况，并根据细胞生长情况补加CIK细胞维持培养基；
2 Q. W- I( P3 M7 X2 K" H4.11DC-CIK共培养用, o4 G2 m3 i& V, ]2 D& J9 d$ i# e. v
    4.11.1收集培养至第7-8天的DC细胞，按DC:IK=1;10-1;100的比例将DC细胞分配到CIK细胞中，并补加B，培养过夜后再次补加B；
7 j& P. O0 E* g' U! f/ D: L4.11,2以后每天观察细胞状况并根据生长情况补加CIK细胞维持培养基；' P0 `# S3 b: G
    4.11.3第9天，观察细胞生长情况，预计回输日期，在预计的回输日期前2天取样做细菌、真菌、内毒素检测；
8 W4 Y+ q2 n/ O% W4.12回输  a; \$ g5 c2 _+ w
4.12.1首先观察细胞生长状况，观察有无污染，结合细菌、真菌检测结果确定是否适合回输。
& M+ v6 `4 F0 ]0 l4.12.2如果适合回输则收集细胞。将适量细胞培养悬液至50ml离心管中（根据细胞总数和生长状况确定每次收集的培养悬液的体积），取样计数、计算活率。1500rpm（或400g）离心6分钟，上清留样两份，一份用于下次细菌、真菌、内毒素检测，另一份冻存于-86℃冰箱备查（保存至回输结束后三个月），其余的弃掉，沉淀在掸散后用生理盐水洗涤2遍（1500rpm离心6分钟）后用含2%人血白蛋白的生理盐水重悬至100ml，做好标记（主要表病人姓名、生产批号）后，填写好相关记录后交护理人员送病房回输。' `' Y5 |* t: Q6 z/ x
4.12.3剩余细胞视情况补加CIK维持培养基继续培养用于以后几次的回输。
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