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4.1 抽取患者外周血200ml(或机采80ml) ，转入50ml离心管，用生理盐水按血样：生理盐水=1:1的比例稀释混匀；# L% W: A Z: D1 v
4.2将淋巴细胞分离液（密度1.077）加入50ml离心管，每管加入20ml；
2 @: C: s1 [. l 4.3将稀释血样缓慢加到淋巴细胞分离液（上步准备好的）上面。(加样时注意：将离心管倾斜45度左右，在淋巴细胞分离液液面以上1cm左右处，缓慢加入稀释后的血样，不要打乱液液界面)。稀释血样量：淋巴细胞分离液量=1.5:1，室温下，于2000rpm(或800g) 离心20分钟，注意离心机升速和降速都调至最低；% h* n, J$ Y" Y" {" F3 B. Y x- }8 v
4.4用平口巴士吸管轻轻插入到PBMC层（即白色细胞层），沿管壁小心吸取该层细胞到另一支50ml离心管中，用生理盐水调体积至50ml混匀，1500rpm（或400g）离心6分钟洗涤2遍，洗涤最后一遍时取样计数、计算活率；7 C( U1 x3 r4 l0 w/ f+ u
4.5弃上清，细胞用80mlRPMI1640培养基重悬后接入T75培养瓶中，每瓶接20ml。用记号笔做好标记（主要标记病人姓名、生产批号、接种日期、操作者姓名简写）后置37℃、5%CO2培养箱孵育1小时；
" j, L9 C$ G$ E3 _& _4.6轻晃培养瓶，收集悬浮细胞于50ml离心管中，然后用无血清RPMI1640培养基洗涤培养瓶中的贴壁细胞2遍，洗出的细胞与前面收集的悬浮细胞合在一起（用于制备CIK细胞），然后向培养瓶中加入DC细胞初始培养基后置于37℃、5%CO2培养箱中培养；
5 m6 Q6 _1 {- _% q2 ~ E8 \: }1 B7 O: \ 4.7第3天开始视细胞生长情况补加DC细胞维持培养基；4 R _9 t% m7 H ?) i9 f
4.8第5天加入肿瘤抗原（终浓度1%）；; d7 M5 }, p* | V, b
4.9 第六天加入H，取样做细菌、真菌检测；6 b, [# r. q9 B! I. T1 T' c
4.10CIK培养
6 O8 z* l( `% A. `, `, z% W% H8 V4.10.1取4.6步中的非贴壁细胞用于CIK细胞的培养。离心收集细胞，用CIK初始培养基按1-2*106/ml的密度重悬细胞接种于培养瓶（少于100ml时）或培养袋（多余100ml时）中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养；% Y( `- p! o9 J6 g2 O! \
4.10.2以后每天观察细胞状况，并根据细胞生长情况补加CIK细胞维持培养基；; c9 ]& u4 n8 {' k$ `
4.11DC-CIK共培养用. ?" m9 V* L5 d+ t/ r. Y+ X" r* l
4.11.1收集培养至第7-8天的DC细胞，按DC:IK=1;10-1;100的比例将DC细胞分配到CIK细胞中，并补加B，培养过夜后再次补加B；1 [' O5 {: J r' _
4.11,2以后每天观察细胞状况并根据生长情况补加CIK细胞维持培养基；7 M+ I2 I; m- @
4.11.3第9天，观察细胞生长情况，预计回输日期，在预计的回输日期前2天取样做细菌、真菌、内毒素检测；
7 b4 y, R3 R& y9 \# ^4.12回输 s; V, A* w8 w6 n) a2 S
4.12.1首先观察细胞生长状况，观察有无污染，结合细菌、真菌检测结果确定是否适合回输。% r$ G) S5 g4 Y3 y
4.12.2如果适合回输则收集细胞。将适量细胞培养悬液至50ml离心管中（根据细胞总数和生长状况确定每次收集的培养悬液的体积），取样计数、计算活率。1500rpm（或400g）离心6分钟，上清留样两份，一份用于下次细菌、真菌、内毒素检测，另一份冻存于-86℃冰箱备查（保存至回输结束后三个月），其余的弃掉，沉淀在掸散后用生理盐水洗涤2遍（1500rpm离心6分钟）后用含2%人血白蛋白的生理盐水重悬至100ml，做好标记（主要表病人姓名、生产批号）后，填写好相关记录后交护理人员送病房回输。
+ N+ Y, W6 [; ~8 i! N4.12.3剩余细胞视情况补加CIK维持培养基继续培养用于以后几次的回输。2 ^) {: W/ k9 J( F" Y: ^+ k
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发表于 2015-10-15 11:22
发表于 2015-12-11 11:49
