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1.操作方法：
, C$ R! B+ H' [! ~* H0 Y' V3 `+ v组织要剪得小，1个立方毫米左右。- k. Q t. B6 _4 J, |) y: e$ r& G- i9 ^8 H/ g
组织块要一个一个的点在培养皿上，每一个组织都要放实，就是组织充分和平皿接触，但是过程要快一点，不要让胶质干了。2 G) R- T. y' O, q, w
; [- D7 C% M/ D) }4 [% u/ S- t B把放好组织块的培养皿放置在培养箱里静置，大概2小时左右，看组织块大小情况，目的是让组织块粘附在平皿上。. ~! h- `3 E: i' }, H
组织块粘好后，加入含血清的培养基，血清一定要好，进口的胎牛血清，一般10厘米的平皿，加8-10毫升培养基。' u5 y8 W, \/ `& y
9 j! M! L) |$ `7 Q- c加培养基的时候，慢慢的加，不要把组织块冲起来，轻轻晃动，让培养基分布均匀。
% c& P) Q( [. _; @加完培养基之后，把平皿放到培养箱里，大概7天以后再拿出来看，这期间，只开培养箱看看液体有没有变浑浊，是否污染，不要挪动平皿，更不要频繁拿出来观察。# ~) c$ ?1 m/ o* I! Q:如果都做到了，期待是新鲜的，基本不会有什么问题，我这么教师妹做，个个都做的出来。6 R0 h0 o, U, f2 q5 s* Q$ c t
需要注意的是，组织块不要用PBS什么的洗来洗去，会降低胶质的粘附能力。7 j6 s, Z* v6 W9 T; 脐带在解剖前做好灭菌，我们用的是75%乙醇，之后大量PBS清洗。
5 D7 C: j9 d- G( @. f6 \9 [' X从开始解剖分离胶质，组织就不能再和液体接触了，不然组织都贴不上。8 P: k& f/ ~+ L2 l' E4 |
除了分离血管，羊膜也一定要去除，那个东西很致密，细胞不容易出来的，而且也不怎么贴壁，除非你能保证你用组织块贴壁的时候，接触平皿那一面肯定是胶质。0 w3 k# D( ]) D* \# R7 ?2 R* W5 u8 I
最后再说，血清很关键，普通的GIBCO根本不行，我试过，很难长出来的，对于新手来说，一定要用高品质的进口胎牛血清才能保证细胞爬出来的多。
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" [& k7 l6 d5 F, e. P9 G2.组织块贴壁法，顾名思义就是要让组织块贴于培养瓶细胞面上，如果都是漂着的，细胞根本不会生长。你可以将组织块剪碎后均匀铺壁，待贴壁几个小时候后再缓慢加入少量的培养液。这样细胞就容易从组织块中爬出细胞。4 H. e' h+ Z" _# h* X+ V
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3.铺瓶后不要直接加培养液啊，不然肯定会直接飘起来的，铺瓶后应该倒置培养4~6h（或过夜）后在加入培养基正置培养，一般7~14d即可会看到细胞爬出。
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4.还有 就是在运输过程中，脐带都是浸泡在生理盐水加双抗中，大概2个小时左右，做之前也是哪pbs冲洗一下。之后也没有pbs反复冲洗，是和浸泡的时间长有关吗？: @& r1 f& g4 \
不知你的双抗浓度是多少，我觉得抗生素对细胞也是有一定的影响，如果你用的抗生素浓度大，而且还没有好好洗涤的话。( w$ n6 B$ u8 }2 O) x4 Q, ~
* Z7 A+ ]# ^: x- _7 q0 ]) T! ^至于运输两个小时，影响倒是不大，我做过放了将近十个小时的，也是可以出细胞的。
2 U N3 F1 H' }2 F9 t你应该还是从你接种组织块的手法，还有培养基和血清方面找找原因。 E$ M6 L6 |' i
血清很关键的，我曾经用GIBCO的普通血清，做了一个多月，好几例，死活就是不出细胞，后来换了德国的一个胎牛血清，7天就有很多细胞出来了。好像海克隆的胎牛也不错，可以试试。, U/ G/ |1 ]+ I8 \* k
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如果是下午做的（3、4点钟）一般会过夜后第二天早上添加培养基再正置培养，如果上午做的完全可以倒置4~6h后再添加培养基即可；即使是过夜后添加培养基胶质也不会干的，因为是在培养箱内倒置培养的，又不是室内环境，我们一直都是这样做的，好几年了没有问题。5 o, G" ^7 K9 \. _
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1.组织块尽量小一点，我们实验室用的组织分离器处理，组织块基本上都分离成组织匀浆，培养效果不错。
! `9 [# }0 C0 p2.还有就是加入的培养基的量，只要能刚刚浸润组织块即可，不要加入过多，造成组织块悬浮，这样细胞很难爬出贴壁的。 k: K& ~' c) Q7 C
: o- E0 j5 C6 R7 `0 i) u- T3.分享一个小技巧，可以先在培养瓶中加入少量的培养基，以25cm2为例，一般加入1-2ml即可，然后再加入处理好的组织块，3 v. S8 X& Z1 S1 O9 Q
Y- ~# B4 L1 s( J' \& L0 T这样可以避免后加培养基将组织块吹散起来了可能性了。+ y l4 ?5 {% c7 F
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先分离华通式胶 剪碎 这个是越碎越好 平铺在培养瓶上 放培养箱干4个小时 然后再加培养基 按照组织块培养费 換液培养 这样可以解决你的贴壁问题 用干贴壁做 组织块能贴得很紧的 但是后续操作要轻拿轻放 不要让组织块被培养基冲下来；其实 由于华通式胶含间充质纯度高 用一般组织块贴壁法做 即使贴壁不好 也能长出细胞 只是细胞爬出多少的问题，你如果真的是没有细胞爬出 很有可能是你的培养基体系问题；我是脐血库的 天天养脐带，应该是这样
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6 x7 T5 T& U: c9 I那你们比较厉害，请问脐带是怎么保存的？我做过的都是24小时之内就分离培养了。
' m2 t8 N |2 ?. s' Q) d9 j9 \我最近在考虑以后要不要给孩子存干细胞，要是脐带放半个月也可以分出干细胞，那我估计我可以在实验室自己做。# F& j& e* G$ W, |* e) K7 F' l* i5 V9 K# ~5 }# _
看前面你说自己是脐血库的，有几个很好奇的问题，你们养细胞用什么培养基？用不用血清？还有就是你们用胶原酶么？我感觉胶原酶分出来的细胞没有组织贴壁的好，你应该做的比较多，有什么体会？
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# }0 F! {6 |5 I) |+ L/ i: c$ U4 `肉泥只适合做干贴壁法吧，常规组织块法做的话 你剪这么碎基本长不出来细胞的，剪成2-3mm差不多，太大太小都不利于贴壁 这个只有你慢慢摸索了。
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我是以前收集的一些资料，分享给你！ |
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发表于 2015-11-22 12:37
